杆状病毒载体表达系统可提高医用蛋白质产量

采用哺乳动物细胞如中华仓鼠细胞、人胚肾细胞生产医用蛋白质成为现在医药领域的研究重点。随着市场需求的扩大，对医用蛋白质药物的产能提出了更高的需求。研究发现构建高效的杆状病毒载体表达系统可以提高哺乳动物细胞医用蛋白质的产量。

杆状病毒载体表达系统是一个利用杆状病毒作为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统，目前已经成为包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统在内的4大表达系统之一。美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，其拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。杆状病毒载体表达系统对外源基因容量大，适合表达细胞毒性蛋白，安全性且表达产量高，其后加工过程完全，可以同时表达多个外源基因还可以在体内表达。然而杆状病毒载体表达系统的缺点就是瞬时表达且糖基化简单。

构建高效的表达载体系统是提高哺乳动物细胞医用蛋白质产量的首要策略，也是目前制约医用蛋白质产业化的瓶颈。外源基因可以通过质粒载体转染或病毒载体感染的方式导入哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。传统质粒载体需要转染宿主细胞获得稳定表达，耗时费力，不利于医用蛋白质的大规模生产。目前，病毒载体主要以杆状病毒载体和慢病毒载体最为常用。

一般来说，人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有便于载体扩增和大量制备的原核序列，如复制子和抗生素抗性基因等，以及调控外源基因转录与翻译活性的启动子、增强子、终止子和polyA 信号序列等真核生物表达序列。优化调节启动子、增强子及其相关转录调控元件有助于高效表达外源基因。杆状病毒载体表达系统具有很好的生物安全性。杆状病毒对包括人在内的哺乳动物无致病性，不能在哺乳动物细胞中复制。进入哺乳动物细胞的杆状病毒会被降解，未见杆状病毒整合到哺乳动物细胞染色体上的报道。杆状病毒载体表达系统是高效的重组蛋白生产系统，109 个培养的昆虫细胞能产生100mg的重组蛋白。

杆状病毒载体表达系统能够对表达的重组蛋白进行多种翻译后修饰，如二硫键形成、磷酸化、酰化、糖基化、寡聚化和折叠。杆状病毒的克隆容量可达38kb，可载有多个外源基因及其调控元件。杆状病毒载体表达系统即可表达单一重组蛋白，又可同时表达多个重组蛋白。在昆虫细胞中，表达的单一重组蛋白或多个重组蛋白可形成具有良好抗原性的病毒样颗粒。

目前用于杆状病毒载体系统表达的病毒疫苗主要有以下几种

（1）人乳头瘤病毒（HPV）疫苗

HPV主要引起皮肤、黏膜的良性或恶性肿瘤如宫颈癌。HPV基因组的早期区部分编码的E6、E7蛋白为癌蛋白；晚期区编码的衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，是引起人体免疫反应的主要蛋白。1994年，利用杆状病毒表达系统表达出L1、L2蛋白，并组装成病毒样颗粒蛋白（VLP），具有典型的HPV结构基础。通过实验发现，VLP可以与单克隆抗体发生反应。经动物试验后，发现该VLP可以激发免疫的动物的体液免疫系统及细胞免疫。此外，研究发现该VLP还可以作为多重抗原表位的载体，产生佐剂的效用。

（2）艾滋病病毒疫苗　

人类免疫缺陷病毒（HIV）是引发艾滋病的病原体，目前发现其有HIV2两种亚型。利用杆状病毒载体表达系统构建获得的无传染性的VLP通过实验发现其可诱导细胞免疫和中和抗体免疫反应。而在小鼠黏膜免疫实验中发现既有黏膜免疫反应，又有系统免疫反应。该疫苗已经于20世纪80年代进入临床实验，但最终因该疾病的特殊性，所以未能走入市场大范围使用，但仍未艾滋病疫苗的研制提供一种新思路。

（3）动物疫苗

目前使用杆状病毒载体表达系统研制出的具有免疫效力的亚单位疫苗如禽流感病毒、牛疱疹病毒、犬细小病毒、蓝舌病毒、口蹄疫病毒、圆环病毒疫苗等。除圆环病毒疫苗外，大多数疫苗仅限于实验室疫苗，未能应用于市场。2006年勃林格殷格翰公司在国外市场首次推出猪圆环2型病毒疫苗，并很快占领该疫苗超过60%的市场份额。2010年该疫苗引入国内，成为国内兽用疫苗市场上首个针对猪圆环病毒的疫苗。通过长期的使用和实践证明该疫苗具有较好的保护力，应激反应小，为目前圆环疫苗市场的主力产品。利用杆状病毒载体系统表达的禽流感病毒H5型和H7型的HA，牛副流感病毒3型蛋白都具有良好的抗体中和反应。

（4）细菌疫苗

与病毒疫苗相比，针对细菌感染的亚单位疫苗的报道较少，至今未能有成功的重组细菌疫苗供人类使用。而使用杆状病毒载体系统表达的细菌疫苗更少，目前仅见到有使用杆状病毒载体系统表达布鲁氏杆菌热激蛋白的报道。

（5）寄生虫疫苗

寄生虫的结构较病毒要复杂的多，同时在人体或哺乳动物体内经历不同的发育生长阶段，具有不同的生长状态和模式，会出现免疫逃避的现象，种种因素导致寄生虫疫苗的研究和发展。近年来，通过使用多基因疫苗免疫策略突破了寄生虫免疫的障碍。利用杆状病毒载体表达系统对恶性疟原虫、血吸虫等寄生虫进行重组蛋白、抗体方面的研究。

杆状病毒载体可以通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒，感染多种哺乳动物细胞，并在合适的启动子控制下表达外源基因，加上杆状病毒载体具备基因组大、操作性好、靶向性强、生物安全性高等优点，已成为一项比较成熟、安全、经济、高效的蛋白质表达技术，被越来越多地应用于哺乳动物细胞生产多肽药物和疫苗等医用蛋白质的研制。