李劲松，于翔最新文章：CRISPR技术构建基因功能分析方法

　　来自中科院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组和中国科学院神经科学研究所于翔研究组合作发表了最新成果：利用CRISPR/Cas9技术和细胞谱系示踪技术对小鼠两细胞胚胎中的单个卵裂球进行了基因敲除，一步法获得了Tet3基因敲除的健康嵌合小鼠，并对Tet3基因敲除后大脑皮层和海马神经元的突触传递进行了探究。该方法是一种快速地分析致死基因在各个组织器官中功能的新方法。

　　这一研究成果公布在Cell Research杂志上，文章的通讯作者是李劲松研究员和于翔研究员，第一作者是汪凌波博士和李敏寅博士。

　　DNA双加氧酶Tet3是Tet蛋白家族的一个重要成员，之前的研究发现， Tet3全身性敲除小鼠有部分可以发育到出生，但是出生后24小时内死亡。因此，若想研究Tet3在成年小鼠中的功能，需要借助Cre/loxP系统在不同的组织中进行特异性的敲除。这就带来一系列的问题：待研究的组织是否有特异性的Cre小鼠资源；若想在不同组织中研究基因的功能，则需要不同的Cre小鼠；条件性敲除小鼠交配周期长。

　　在此基础上，研究人员提出了一种基于嵌合体的快速分析致死基因潜在功能的方法。

　　首先，他们在mT/mG小鼠胚胎的一细胞时期（受精卵时期）注射了Cas9 mRNA，而后在两细胞时期，随机地在两细胞的其中一个卵裂球注射Cre mRNA和Tet3 sgRNAs。将这些注射过的胚胎移植到假孕小鼠体内，就可以获得Tet3敲除的嵌合鼠，这些嵌合鼠可以正常成活，并且在各个组织器官中都有红色/绿色两种细胞存在，其中红色细胞是野生型，绿色细胞是Tet3敲除的。为简化基因型鉴定同时为保证敲除的成功率，研究人员进一步将多个sgNRAs（3-4个）注射到单个卵裂球中，这种策略得到的小鼠很容易通过PCR条带鉴定出是否有大片段敲除，同时可以把一整个外显子删除掉保证了敲除的成功率。他们对这些嵌合体小鼠的大脑进行分析，发现Tet3敲除并不影响大脑皮层主要细胞类型的发育和分化。

　　之后研究人员进一步通过对邻近的野生型和Tet3敲除细胞进行成对电生理记录，发现Tet3敲除之后，小鼠大脑皮层和海马锥体神经元的兴奋性与抑制性突触传递均发生了显著性的改变，表现为兴奋性突触传递的上调和抑制性突触传递的下调。研究结果提示Tet3在大脑不同脑区神经环路的发育中起到了重要的作用。

　　这种技术方法的优越性主要在于：对于致死基因，可以一步法获得嵌合小鼠，用于探究该基因在不同组织器官中的作用；在同一个个体内，野生型细胞是基因敲除型细胞的严格对照；基因敲除型细胞可以零星地散布在各个组织中，有助于研究基因的自主性和非自主性功能。