李劲松课题组CellStemcell用CRISPR构建多重基因修饰小鼠

　　来自中科院上海生命科学研究院的研究人员报告称，他们找到了一种方法来提高利用小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系(AG-haESCs)生成半克隆小鼠的效率。并证实借助于CRISPR-Cas9技术可构建出多重遗传修饰的半克隆小鼠及实现对其的诱变遗传筛查。这些重要的研究结果发布在7月9日的《细胞干细胞》（Cell stem cell）杂志上。

　　中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所的李劲松（Jinsong Li）研究员、吴宇轩（Yuxuan Wu）和上海生科院计算生物研究所的杨力（Li Yang）研究员是这篇文章的共同通讯作者。

　　在有性生殖中，单倍体配子（卵子和精子）通过受精结合成二倍体的受精卵开始一个新生命，并且将自身的遗传物质延续给后代。这样的一个生命周期中，由减数分裂获得的单倍体配子需要进一步高度特化，形成特定的结构及功能以完成受精过程。然而受目前的研究技术和手段的限制，仍无法实现卵子和精子在体外进行长期的扩增和培养，大大阻碍了科学家们对单倍体配子的基础研究以及体外的遗传操作。

　　2012年，李劲松课题组率先提出了采用AG-haESCs获得生殖系嵌入小鼠的构想。他们采用流式富集的方法获得了AG-haESCs，分析这些AG-haESCs的印记基因表达情况，证实AG-haESCs很大程度上仍维持着典型的父本印记。通过采用胞浆内孤雄单倍体胚胎干细胞注射（ICAHCI），将AG-haESCs注入到卵细胞获得重构的胚胎中，证实这些胚胎能够在体外正常发育到囊胚，移到假孕母鼠的子宫内，也能够发育为健康的小鼠，称之为半克隆小鼠（SC mice）。这一重要的成果发表在《细胞》(Cell)杂志上。

　　然而相对于正常的ICSI技术获得健康小鼠的效率而言，AG-haESCs这种“人造精子）进行ICAHCI获得半克隆小鼠的效率极低，限制了这种方法的实际应用。在这篇Cell stem cell文章中，研究人员报告称发现印记基因的错误表达阻碍了AG-haESCs生成半克隆小鼠。而采用父源印记基因H19和Gtl2控制区域——差异性甲基化区域(Differentially Methylated Region，DMR)缺失的AG-haESCs，则可有效地生成半克隆小鼠。

　　CRISPR/Cas9是近年来新兴的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，目前已经成功应用于大、小鼠基因KO/KI的模型制备。在这篇新文章中，研究人员证实利用CRISPR-Cas9技术来遗传操控这些DKO-AG-haESCs，可以高效率地生成多重遗传修饰的半克隆小鼠。并且，通过将组成性表达sgRNA文库和Cas9转染进DKO-AG-haESCs细胞可允许进行功能性诱变筛查。这些DKO-AG-haESC为在一代内构建出整个生物体携带突变的小鼠提供了一个有效的工具。