来来来，大神教你如何冻存细胞，里面窍门可多啦~

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH 值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核 DNA 空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂（渗透型），这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。对于一些原代细胞（皮肤细胞），除渗透型保护剂外，还会适当添加表面型保护剂（海藻糖），以提高细胞存活率。

所需材料

1. 超低温冰箱或液氮罐

2. 0.25% 胰蛋白酶

3.20% 以上血清的完全培养液或血清

4. DMSO(分析纯) 或无色新鲜甘油 (121℃ 蒸气高压消毒)

5. 2 ml 专用细胞冻存管

6. 吸管、离心管、喷灯、冻存管架

贴壁细胞的冻存

1．选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用 0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心 (200 g，5 分钟)。

2．去上清液，加入含 20% 以上小牛血清的完全培养基或血清，于 4℃ 预冷 15 分钟后，加入 10% 的 DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为 3×106～1×107 /ml 之间。

3．将上述细胞分装于冻存管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记 (日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

4．先将冻存管置入置于 4℃ 30 min，再转入- 20℃ 2 h 后，再放入- 80℃ 冰箱冷冻过夜，次日保存到液氮罐中。

目前更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降 1℃。目前也有商业化的快速冻存液，可不经过程序降温过程，直接置于超低温冰箱。

注：细胞冻存后可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一支冻存管的细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

悬浮细胞的冻存

1. 直接将细胞收集到离心管

2. 200 g 离心 5 min，弃上清

3. 以生长培养基（含 20% 胎牛血清）或 100% 胎牛血清重悬细胞至终浓度约 107 /ml，加入 10% 的 DMSO。

4. 以每管 1 ml 分装至冻存管中。

5. 置于 4oC 30 min，再转入- 20℃ 2 h 后，再放入- 80℃ 冰箱冷冻过夜，次日保存到液氮罐中；或置于程序降温盒中，按相关的操作指南进行操作。

液氮罐使用注意事项

1．初次使用前检查容器内胆是否清洁干燥，外部有无凹陷及严重碰伤，如有轻微凹陷及碰伤，经试验其蒸发性能不变，仍可继续使用，如性能下降，应停止使用，避免经济损失。

2．液氮容器应放在阴凉干燥处，应有良好的通风，不应放置在靠近热源，阳光直照，以及风口处，严禁放置液氮容器的房间紧闭门窗，以免室内因液氮蒸发使氧气含量下降，造成呼吸困难。

3．只能用于充装液氮，冻存细胞和病毒用，严禁充装液氧等易燃易爆及腐蚀性液体，以免产生猛烈燃烧、爆炸或对容器产生腐蚀。
液氮是超低温液体（- 196℃），在充装时，要穿长袖工作服、带皮手套，以避免液氮飞溅造成冻伤。
贮存容器不得作贮运容器使用。若运输液氮。必须使用 B 型贮运容器。因此类容器有特殊支撑结构, 坚固可靠不易损坏。

4．液氮容器在使用过程中，每天都应随时检查容器的使用情况，如发现容器瓶盖上和上部有水珠或结霜情况，说明容器质量出现问题，应立即停止使用。

5．存入取出样品要标记，拿取东西要轻拿轻放。