果蝇RNA的大规模制备

试剂、试剂盒 5mol LLiCl 70% 乙醇 酚：氯仿（1:1) 20 mg ml 蛋白酶 K 95%(V V) 乙醇 .RNA 匀浆缓冲液 3mol L 乙酸钠

实验步骤

一 材料与设备

1)5mol/L LiCl

2)70% 乙醇：70% (V/V)Ethanol，l0 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)

3) 酚：氯仿（1:1): 酚用 0.1mol/L Tris-HCl(PH8.0) 平衡

4)20 mg/ml 蛋白酶 K

5)95% (V/V) 乙醇

6)RNA 匀浆缓冲液：0.5%(m/V)SDS, 10 mmol/L EDTA\(PH8.0)，50 mmol/L NaCl，高压灭菌，加入 Tris-HCl (PHI7.5)  至终浓度为 50 mmol/L

7)3mol/L 乙酸钠 ( PH5.5 )。

二 操作方法

1) 吸取 2 mlRNA 匀浆缓冲液到 7 ml 的 Dounce 匀浆器中。

2) 加入 37.5 蛋白酶 K，再立即放入果蝇或其胚胎。用 A 型研杵均匀地匀浆 50 下。

3) 匀浆匀浆液转移至 15 mL 锥形管中。37℃ 温肓 45〜70 min

4) 如入等体积的酚：氯仿，盖紧后振摇混合 10s

5) 以 1000 g 离心 5 min 分离冇机相和水相。

6) 上层水相转移到一个新管中

7) 有机相中加入 1 ml 新的 RNA 匀浆缓冲液. 混合后再按前述方法离心分层。

8) 混合两次的水相，再加入 4 ml 酚：氯仿。

9) 以 1000 g 离心 5 min, 分离冇机相和水相。

10) 上层水相转移至一新管屮，加入 0.5 ml3mol/L 乙酸钠. 颠倒混合后加入 2〜2.5倍体积的 95% 乙醇，颠倒混合。

11)—20℃ 放置 2 h 或—80℃ 放至凝固，以沉淀 DNA 和 RNA

12) 以 12000 g 离心 lOmin, 弃上清。再用 5 ml70% 乙醇漂洗沉淀，去掉上清

13) 在空气屮或真空屮干燥沉淀. 用 0.5 mlDEPC 水溶解沉淀. 并转移到 1.5 ml 的离心管屮。

14) 为去掉 DNA, 加入等休积的 LiCl 并振摇混合。

15)—20℃ 放置 2 h 或 4℃ 过夜以沉淀 RNA

16) 以 12000 g 离心 10 min, 去上清并在空气中干燥或真空干燥。

17) 用 0.4 mlDPEC 水溶解沉淀. 可 4℃ 放置过夜以溶解

18) 加入 50ul3mol/L 乙酸钠和 0.9 ml95% 乙醇. 颠倒混合后-20℃ 放置 2 h 以沉淀 RNA

19) 在微量离心机屮以最大转速离心 10 min, 去上淸，再用 0.5 ml70% 乙醇漂洗沉淀

20) 在空气或真空屮干燥，用 180ulDEPC 水溶解沉淀。分装成适当的体积于-70℃ 保存。

注意事项

1) 本方法可从果蝇成虫或胚胎中制备 RNA。对胚胎而言，须先去膜，再中和，使用前用 DEPC 水漂洗去膜的胚胎。

2)RNA 沉淀在真空屮干燥后可能较难溶解，可以在加热几分钟并用吸头轻轻混合以帮助溶解.

3）A260/280 应该大于或等于 1.9，如果比值低于 1.9, 则可能是在 RNA 制备中有蛋白污染。可以通过酚：氯仿抽提的方法去掉蛋白。