染色的基本原理、方法及注意事项

涂片及染色是微生物学的基本技术，也是观察细菌最简单且行之有效的方法。通常情况下，由于细菌个体较小，较透明或半透明，如未经染色往往不易观察识别。因此借助于染色法可使细菌着色，与视野背景形成鲜明对比，从而易于在显微镜下进行观察。

简单染色法即只用一种染料对涂片进行染色，该法简便易行，适用于菌体的一般形态观察。通常情况下由于细菌菌体多带负电荷，易和带正电荷的碱性染料结合而被染色，因此常用碱性染料进行简单染色，如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、番红等。所有的苯胺染料，均可用来做简单染色法的染色剂。在进行染色之前的制片过程是影响染色结果好坏的关键性步骤。

制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤(见下图),然后用显微镜，甚至油镜观察。

(一)涂片

取一干净的载玻片，滴加一小滴蒸馏水于载玻片中央。按无菌操作要求，接种环经灼烧灭菌，待冷却后用接种环从菌种试管斜面上(培养皿表面)挑取少量培养物(不要挑破培养基),置于载玻片上的水滴中，与水混合并轻轻涂布成直径约1cm左右的均匀薄层。操作完成后，接种环要再经灼烧灭菌，放归原处。

(二)干燥

将涂片于室温中自然干燥或者置于酒精灯火焰高处，微热烘干。切记不能直接在火焰上烘烤，以免菌体烤焦变形，影响对菌体的观察。

(三) 固定

涂片标本面向上，快速通过酒精灯火焰外焰2次~3次，进行标本固定。固定的目的在于杀死细菌以固定其细胞结构；保证菌体牢固地粘附在载玻片上，染色或水洗时不至于脱落；同时改变菌体对染料的通透性，有利于着色，增强染色效果。固定时，以载玻片背面加热处触及皮肤而不觉过烫为宜(一般不超过60 ℃ )。

(四)染色

标本玻片水平放置，滴加1滴~2滴染色液，使染色液完全覆盖涂片区域，染色时间视不同标本和染料的性质而定。

(五)水洗

染色到一定时间后，倾去染液，斜置玻片， 自玻片上端用自来水冲洗至流下的水无色为止；或将玻片置于玻片架上，用洗瓶倾注水流进行水洗。注意冲洗水流不宜过急、过大，同时要避免直接冲在涂片处，导致涂片受损。

(六)干燥、镜检

自然晾干，或用吸水纸吸去玻片上的多余水分后再晾干，但要注意勿将菌体抹掉。完全干燥后，用显微镜甚至油镜检查。

注意事项：

(1)载玻片要清洁无油污，否则菌液不易涂开。涂片时取培养物宜少，培养物涂层宜薄，涂层过厚则不易观察细菌形态。

(2)干燥和固定时，玻片不能直接在离火焰很近的位置上烘烤，否则会破坏细菌形态并使之变形，影响观察结果。

(3)观察时如需用到油镜，油镜检查前玻片应完全干燥，观察后要将油镜用擦镜纸等彻底擦拭干净。