标记免疫分析技术1

一、标记分析技术概述
1959年，美国学者Yalow和Berson建立了放射免疫分析技术，这种技术以免疫反应的特异性，和放射性同位素标记的灵敏性显示了其在微量检测方面的优势，吸引着各国的生物医学工作者。标记免疫分析技术进入了一个崭新的时期。从而使免疫分析，从定性分析和半定量分析走向了定量分析。医学检测技术也从常量分析走向微量与超微量分析。
标记免疫分析技术的优势主要表现在两个方面：1、高灵敏度：不是直接测定待测物而是探测待测物上的标记信号，利用标记物的放大效应，提高了信噪比，降低了待测物的可测下限。2、高特异性：以抗原、抗体作试剂替代了传统的无机或有机试剂，使检测特异性大大提高。

作为经典的标记免疫分析技术——放射免疫分析技术的缺点是：1、试剂稳定性欠佳，同位素的衰变影响结果。2、放射性污染问题。3、测定方法难以全自动化。
为了克服放射免疫分析技术的缺点，研制放射性同位素以外的标记物——拓宽体外微量分析技术，成了热门的课题。此后酶、化学发光、生物发光、荧光标记等新标记不断涌现，相应的标记免疫分析技术相继问世。
标记分析技术的历史沿革:
1923年 Hevesy：放射性核素示综法。
1959 年 Yalow 和 Berson：放射免疫分析技术。 （Radioimmunoassay， RIA）
1986 年?Miles 和 Hales：免疫放射分析技术。
（immunoradiometricassay IRMA）
60年代 酶标记示踪检测技术（EIA，ELISA）
70年代 Halmann 和 Velan：化学发光免疫分析
（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）
1978年 Halman 和 Barach：化学发光酶免疫标记技术
1979年 Guesdon:生物素－亲合素标记技术。
1979年 Soini 和 Hemmia：时间分辨荧光分析技术。

二、以酶作标记的免疫检测技术
根据抗原或抗体的附着不同，可分为1、“板式酶标”——抗体与微孔板连接，应用得最普遍。2、“管式酶标”——抗体与试管连接，国内应用不多。3、“微粒子捕获法”—— 抗体与微粒连接
各种酶标的特点：
1、板式酶标：孔间均一性欠佳，显色体积太小，比色光径不足，重复性不够理想，精度难以达到ng以下，量程难以达到3个数量级。
2、管式酶标：增加了比色光径与显色体积，部分弥补了“板式酶标”之不足。如：美国ABBOTT公司的Commarder；德国BM公司的ES300；瑞士Serono公司的SR-1。
n ES -300采用链亲和素包被管和生物素化抗体，以增加抗体结合量、增加放大效果。
n ES-300 采用了ABTS， SR-1采用了磷酸酚酞作显色剂，大大提高了显色稳定性。
n SR-1 采用异硫氰基荧光素（FTTC）连接第一抗体和通用的抗FTTC磁化颗粒作B/F分离。
3、微粒子捕获法：微粒子的表面与抗体连接反应面积增加，检测的量程增加。
根据底物不同可分为：1、酶免疫显色；2、酶免疫荧光；3、酶免疫发光。
1、 酶免疫显色：底物成色反应后，底物颜色在可见光范围内。常用的底物有邻苯二胺、甲基联苯胺等。
2、 酶免疫荧光：酶反应的底物改为荧光底物。
（EIFA）
磷酸4-甲基伞型酮
↓
碱性磷酸酶
↓
发荧光的甲基伞型酮
（ABBOTT公司）

3、酶免疫发光：酶免疫反应的底物为发光底物
（EILA）
磷酸金刚烷
↓
碱性磷酸酶
↓
金刚烷
（不稳定，分解时发射光子）
（DPC公司）

三、荧光免疫分析：直接用荧光物质标记抗体或抗原
荧光物质有：
F 异硫氰基荧光素（FTTC）
F 四乙基罗丹明（RB 200）
F 四甲基罗丹明（RB 200）
F 稀土元素（铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和镝(Dy)）
美国ABBOTT公司生产的药物血浓度检测仪TDX，即利用荧光标记药物和样品中药物与抗体的竞争结合来进行测定，当药物分子与抗体结合后，其在偏振光激发下产生偏振，而游离的标记物失去偏振。
镧系元素标记的时间分辨荧光检测技术（TRFIA或DELFIA），以具有双功能基因的镧系元素螯合物作示踪剂，标记抗原或抗体，当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强而持久。用延迟测量的办法可消除样品自身的早期背景荧光而大大提高检测灵敏度