标记抗体的应用技术——免疫斑点试验

过氧化物酶底物

PBS甘油　DABAPAAP复合物

纤维素膜

一、辣根过氧化物酶免疫斑点试验

　　　　　　　
1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上

2.  置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟

3.  滴加封闭液37 ℃温盒中封闭10 分钟

4.  用洗涤液洗1～2 次，滤纸吸干

5.  加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置37 ℃湿盒中30 分钟

6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟、吸干

7.  水洗终止反应，观察结果。出现明显综色斑点者为阳性

二、碱性磷酸酶免疫斑点试验

　　　　　　　
1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜上

2.  置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟

3.  用封闭液37 ℃湿盒中封闭10 分钟

4.  用洗涤液震洗1～2 次，滤纸吸干

5.  加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，置室温湿盒中30 分钟

6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟，吸干

7.  加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，置室温湿盒中30 分钟、洗同前、吸干

8.  加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30 分钟，洗同前、吸干

　　　　　　　
9.  加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿盒中10分钟，震洗1次、吸干

10.  加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”

11.  重复“9”和“10”1～3次

12.  洗涤液震洗3次×3分钟、吸干

13.  滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中止反应，观察结果

一、免疫斑点试验的影响因素　

1.  包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。

　　
2.  酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。

　　
3.  显色时间，一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。

　　
4.  用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10 μl即可。