样本制备方法之蛋白提取的总原则及注意事项

样本制备是实验的*步，也是决定实验成败的关键步骤，获得的蛋白质样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其zui终仅依赖本身的分子量大小进行分离。常见的样本来源有重组蛋白、细胞和组织等。
蛋白提取的总原则和注意事项：
1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度，只集中提取目的蛋白；
2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH盐浓度，表面活性剂，还原剂等的选择）；
3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；
4：尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；
5：样品分装，长期于-80℃保存，避免反复冻融。

细胞裂解：
1. 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
2. 吸尽PBS，加入预冷的裂解液（1ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask）；
3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中；
4. 4℃摇动30mins；
5. 4℃，12000rpm离心20mins；
6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

组织裂解：
1. 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；
2. 将组织放在圆底微量离心管或EP管中，加入液氮冻结组织于冰上匀质研磨，长期可保存于-80℃；
3. 每5mg加入约300ul预冷的裂解液，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例（zui终的蛋白浓度至少达0.1mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml）；
4. 4℃，12000rpm离心20mins，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。