核酸分离与纯化过程中材料与方法

(一)费氏弧菌发光杆菌材料与方法的选择

临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等;核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是zui终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求;至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑;在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。

(二)选择的原则

核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的zui基本的要求;二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。

(三)核酸完整性的保持

为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，费氏弧菌发光杆菌在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害;另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。

其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏; DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，费氏弧菌发光杆菌若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。