核酸探针标记的实验过程

实验原理

分子生物研究中，zui常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。

切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。zui合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。

实验试剂

(1) 10×切口平移缓冲液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)；  0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT；  100ug/ml BSA。

(2) 未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mM/L。

(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4单位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5) DNA酶:1mg/ml。

(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

(7) 10M/L NH4Ac。

实验步骤

(1) 按下列配比混合:

未标记的dNTP 10ul

10×切口平移缓冲液 5ul

待标记的DNA 1ug

[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

E.coli DNA聚合酶 4单位

DAN酶 I 1ul

加水至终体积 50ul

(2) 置于15℃水浴60分钟。

(3) 加入5ul EDTA终止反应。

(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5M/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

注意事项

1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。

2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。