核酸提取技术简史

核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等试验的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的层析柱核酸提取方法有：

（重要东西一般都放在前边的，所以先介绍最新的技术，我们精耐特基因的杀手锏！！！）

时间：2012年

人物：美国科学家丁少峰教授和刘强教授

事件：

发明了一种新的层析柱技术-双层柱技术，以及基于该新双层柱的核酸提取方法，用来克服常用的基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，特别是在血浆和尿液的液体活检中具有非常重要的应用价值^13-14。

结构：

双层柱由2种膜组成：第一层为阴离子交换膜二乙胺（DEAE），第二层为二氧化硅膜 (Fig.1)。

原理：

（1）样品中的核酸结合到第一层阴离子交换膜上，起核酸浓缩器的作用，

（2）已结合的核酸从第一层膜洗脱, 然后结合到第二层二氧化硅膜, 这是因为采用了双功能洗脱/结合液, 也称为耦联液，

（3）最终使用低盐缓冲液将游离核酸从第二层膜洗脱，获得目的产物 (Fig.2)。

优点: 

（1）特别适用于分离和纯化含有极度稀释的大容量的核酸样品，例如10mL血浆或50mL尿液；

（2）游离的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常规硅胶提取法高出4倍, 适用于血浆及尿液游离核酸的提取；

（3）不需要蛋白酶处理；

（4）提供更高纯度和更少抑制剂的核酸样品；

（5）洗脱的核酸可直接用于下游应用, 包括焦磷酸化激活的聚合反应（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代测序等；

（6）此外，本方法快速、简便，无需接触苯酚及氯仿等毒性强烈的有机溶剂，无需复杂繁琐的实验操作，操作全程可在短时间内完成。

以下为常用的两种方法。

时间：1979年

人物：美国科学家Vogelstein教授和 Gillespie教授

事件：发表了一项以硅胶或二氧化硅为基础的提取方法¹。

材料：

微孔玻璃，嵌入二氧化硅颗粒的滤膜，硅胶颗粒，二氧化硅构成的藻土型树脂，和玻璃纤维

步骤：

（1）在高浓度离液盐的存在下，DNA或RNA会粘结到硅胶树脂或膜的表面，其它污染被冲洗走，

（2）然后用水或低盐缓冲液洗脱DNA或RNA，现在已成为一种流行的核酸提取方法^1-6。

原理：

（1）在高浓度的离液盐，例如碘化钠（NaI），高氯酸钠（NaCIO4），盐酸胍（GuHCl）, 和异硫氰酸胍（GuTC）等的条件下，带负电荷的DNA 骨架与带正电的硅胶表面具有高度的亲和力。

（2）现阶段已对离子强度、温度、pH值、DNA大小和构象与核酸结合到硅胶表面上的影响进行了研究，例如，硅胶表面的结合能力与离液盐浓度是呈线性相关的。在一个给定的离液盐浓度下，pH值越低则所有类型的DNA与硅胶表面的结合能力越高⁷。

（3）常用的将核酸与硅胶表面粘结的试剂：异硫氰酸胍（GuTC）、盐酸胍（GuHCl）、碘化钠（NaI）、高氯酸钠（NaCIO4）。条件控制为：在乙醇或异丙醇的条件下, 以及控制结合试剂PH值为6至7.5条件下，其结合效率显著改善。

应用：

这种层析柱常用硅胶树脂或膜作为固定相，并常用离心或真空来驱动,例如：

Promega公司的PureYield质粒小量提取系统

WizardPlus小量DNA制备纯化系统

Qiagen 公司的QIAprep小量制备试剂盒

 Bioland公司的EZgene质粒小量制备纯化试剂盒

优点：

快速、简便、有效、所纯化的DNA质量高并可以用于多种下游应用

缺点：

高达3倍体积的离液盐溶液被添加到1份体积的DNA或RNA样品中方可达到硅胶结合DNA所需的有效离液盐的浓度，因而血浆和尿液液体活检标本的起始体积受到很大限制。

步骤：

在低pH值及低盐浓度下，DNA可与阴离子交换剂结合，随即可用高pH值及高浓度的盐溶液来洗脱DNA^8-11。

原理：

是基于DNA主链上的带负电荷的磷酸根离子与分子表面上带正电的DEAE等基团之间的相互作用，溶液中的盐浓度和pH值决定了是否结合或脱DNA。

应用：

（1）通常以微珠为基础的阴离子交换柱多是重力流动型的，例如QIAGEN公司的基因组柱试剂盒，QIAGEN公司的树脂由有一层二乙基氨基乙醇（DEAE）官能团的涂层；PALL公司的AcroSep层析柱，它是由弱的阴离子交换树脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q强阴离子交换陶瓷HYPERD F微珠组成的。

（2）与基于微珠柱子相比，通常使用的为离心型或真空抽吸驱动型阴离子交换膜式柱子，例如Vivapure弱阴离子交换微型D膜离心柱、Vivapure强阴离子交换Q膜离心柱，它们具有流速高、成本低、高通量的优势¹²。

优点：

简单、安全、可靠，

其所制备的核酸具有相当于两次CsCl梯度离心纯化的超纯度。

缺点：

因为在洗脱液中含有高浓度的盐，洗脱的核酸是不能直接使用的，通常需要一个额外的步骤，例如，乙醇或异丙醇沉淀以去除盐。

综上所述，双层柱提取技术无论是在对样本的处理、实验的操作及获得产物的质量上，都是优于其他两种方法的！

参考资料：

1. Vogelstein, B., and Gillespie, D. (1979). Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76, 615-619.

2. Chen, C.W., and Thomas, C.A., Jr. (1980). Recovery of DNA segments from agarose gels. Analytical biochemistry 101, 339-341.

3. Marko, M.A., Chipperfield, R., and Birnboim, H.C. (1982). A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Analytical biochemistry 121, 382-387.

4. Boom, R., Sol, C.J., Salimans, M.M., Jansen, C.L., Wertheim-van Dillen, P.M., and van der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology 28, 495-503.

5. Boom, R., Sol, C., Beld, M., Weel, J., Goudsmit, J., and Wertheim-van Dillen, P. (1999). Improved silica-guanidiniumthiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. Journal of clinical microbiology 37, 615-619.

6. Thompson, J.D., Cuddy, K.K., Haines, D.S., and Gillepsie, D. (1990). Extraction of cellular DNA from crude cell lysate with glass. Nucleic acids research 18, 1074.

7. Melzak, K.A.S., C.S. Turner, R.F.B. Haynes, C.A. (1996). Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J Colloid and Interface Science 181, 635–644.

8. Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods, GE Healthcare. http://wwwgelifesciencescom/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314823637792/litdoc11000421AB_20110901010317pdf.

9. Teeters, M.A., Conrardy, S.E., Thomas, B.L., Root, T.W., and Lightfoot, E.N. (2003). Adsorptive membrane chromatography for purification of plasmid DNA. Journal of chromatography A 989, 165-173.

10. Endres, H.N., Johnson, J.A., Ross, C.A., Welp, J.K., and Etzel, M.R. (2003). Evaluation of an ion-exchange membrane for the purification of plasmid DNA. Biotechnology and applied biochemistry 37, 259-266.

11. Zhang, S., Krivosheyeva, A., and Nochumson, S. (2003). Large-scale capture and partial purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules. Biotechnology and applied biochemistry 37, 245-249.

12. Ashby, M.K.M., C.W. Rapid Purification of High Molecular Weight Bacterial Chromosomal DNA using the Vivapure 500 and Vivapure 20-D anion exchange membrane devices. Vivascience application note http://sartoriusorkr/Vivascience/Application_Notes/pdf/ASH_IE_0124pdf.

13.  Ding, S.F. and Liu, Q. (2015). Chromatography column and method for isolating nucleic acid. US patent 9,163,230.

14.  丁少峰、刘强 (2016). 一种层析柱及核酸提取方法. 中国发明ZL 2013100980999。