核酸的纯化主要方法和分离纯化核酸时的注意事项（一）

分离纯化核酸时的注意事项：

防止物理因素的降解：

1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。

2.防止热变性，避免高温。一般0-4℃。

3.防止机械剪切作用  动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。

防止化学因素的降解：

1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。

2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。

防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。

1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶

2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。

防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。

操作注意事项：

1.带一次性手套、口罩；

2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。

3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。

常用的抑制RNase活性的方法有：

1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。

使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。（3）冻融数次后应弃之不用。（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。

2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleasidecomplex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。

缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。

3.硅藻土（Macaloid）:是一种粘土，能吸附多种RNA酶。用缓冲液以0.015%（W/V）的终浓度溶解细胞，这种粘土同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中经离心除去。

4.皂土：一种无机物，与酶结合可使其失去活性。

5.DEPC(焦炭酸二乙酯) 

6.肝素（heparin）

7.去垢剂主要分为阴离子型去垢剂、阳离子型去垢剂和非离子型去垢剂三类，近几年又出现了双性离子去垢剂。其作用为：①溶解膜与质膜②使蛋白质变性与溶解③对RNase和DNase有一定的抑制作用④乳化剂去垢剂的效果和作用时间有关，一般以高浓度、短时间为好，因为这样核酸分解较少。常用阴离子去垢剂：①SDS ②LDS ③Sarkosyl ④DOC ⑤4-氨基水杨酸钠 ⑥萘-1,5-二磺酸钠 ⑦三异丙基萘磺酸钠

8.胍类：常用的有盐酸胍和硫氰酸胍，蛋白质的强烈变性剂，能迅速溶解蛋白，导致细胞结构破碎，核蛋白（RNP）由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。

9.RNA酶作用底物：加入小分子的RNA作为RNA酶的底物，可减轻对RNA的水解作用。

10.多胺（polyamine）:反应可逆，抑制不完全。