根据结构信息确定残基的突变是鉴定新蛋白质分子中突变残基最有效最直接的方法。可利用X射线或NMR进行新蛋白质分子的三维结构测定，这种方法可以直接提供突变蛋白的高分辨率结构及评估结构整体性。根据新测定的三维结构与突变前的三维结构进行分析比较。重点分析突变位点的氨基酸残基在三维结构中的位置，以及与其他基团之间形成的氢键、离子对或疏水相互作用等，以证实该位点残基在蛋白质分子的结构与功能中的作用。Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰一tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3'羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。蛋白质三维结构的测定，可用于鉴定最暴露于蛋白质表面的残基，还可用于估计专一性突变对结构改变的可能性。这种方法需要较大量的纯的突变蛋白，并要花较长时间，因此这种技术不能用于常规的大量突变体的分析。