检测自噬的方法有哪些

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）bredeldin
a
/
thapsigargin
/
tunicamycin
：模拟内质网应激
2）carbamazepine/
l-690，330/
lithium
chloride（氯化锂）：impase
抑制剂（即inositol
monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）n-acetyl-d-sphingosine（c2-ceramide）：class
i
pi3k
pathway抑制剂
5）rapamycin：mtor抑制剂
(最常用)
6）xestospongin
b/c：ip3r阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-methyladenine（3-ma）：（class
iii
pi3k）
hvps34
抑制剂
2）bafilomycin
a1：质子泵抑制剂
3）hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义rna干扰技术（knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
（三）自噬检测方法：
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）western
blot检测lc3的切割
利用western
blot检测lc3-ii/i比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型lc3会酶解掉一小段多肽形成lc3-i，lc3-i跟pe结合转变为（自噬体）膜型（即lc3-ii），因此，lc3-ii/i比值的大小可估计自噬水平的高低。
2）在荧光显微镜下采用gfp-lc3单荧光体系/mrfp-gfp-lc3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：
gfp-lc3
单荧光自噬指示体系：
利用lc3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出gfp-lc3指示技术：无自噬时，gfp-lc3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western
blot
检测游离的gfp、p62来验证。
另一种方法是利用mrfp-gfp-lc3
。
mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系：
由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪lc3以及自噬流的变化。其中gfp是酸敏感型gfp蛋白，而mrfp是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致ph下降，gfp淬灭，因此，gfp的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，gfp越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mrfp是一直稳定表达的，因而可以通过gfp与mrfp的亮点比例来评价自噬流进程。
mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。
3）透射电镜下观察自噬体的形成：
自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)
透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。