棉花耐盐相关基因GhVP的表达及功能分析

土壤盐渍化是世界范围内限制农作物产量和品质的重大问题。棉花是改良盐碱地的先锋作物。培育棉花耐盐品种，开发利用大面积盐碱地是棉花种植的必然趋势，通过分子生物学手段挖掘棉花耐盐相关基因，创新棉花种质资源，对棉花耐盐性研究尤为重要。

系统进化分析表明 GhVP 与盐生植物盐爪爪、灰绿藜的亲缘关系最近，进一步说明GhVP 基因在陆地棉适应盐胁迫机制中发挥了积极作用。关于 GhVP 的报道已经有很多，都证明这个基因与植物耐盐性有密切的关系，它在盐胁迫代谢网络中发挥重要作用。但对此基因在棉花上的定位和表达分析却未见报道。在真核细胞和高等植物中，采用绿色荧光蛋白 GFP 结合使用激光共聚焦显微镜，来研究细胞内蛋白质的表达，从而实现对目标基因进行亚细胞定位是 1 种常用的手段。

中国农业科学院棉花研究所立题《棉花耐盐相关基因 GhVP 的表达及功能分析》，针对棉花 GhVP 基因的洋葱表皮亚细胞定位和棉花花粉瞬时表达进行了研究，在进一步探索该基因的分子机制以及耐盐新材料创制提供了理论依据。此次研究中，课题组创新性采用棉花花粉进行瞬时表达研究，缩短了实验周期，更快速获得转化植株，为基因功能的研究开辟了新思路。

GhVP 基因的亚细胞定位

将构建好的 pBI121-GhVP∷GFP 载体用金粉包裹，把金粉包裹好的质粒加入基因枪 GDS-80 轰击洋葱内表皮细胞， 在激光共聚焦显微镜下观察。可以看出，空载体 pBI121-GFP 转化洋葱表皮后， 在整个洋葱细胞均能看到绿色荧光。pBI121-GhVP∷GFP 转化洋葱后，VP 蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞膜上，在玻片上加蔗糖，待质壁分离后，GhVP 蛋白在洋葱表皮细胞的细胞膜和细胞间质中均有分布（图3）。结果表明 GhVP 蛋白是 1 个跨膜蛋白， 与细胞质一起维持细胞膨压，可以调节细胞内外的离子平衡，促使细胞达到稳态。

棉花花粉的瞬时表达

由于棉花花粉有自发荧光现象，根据实验室前期研究结果，选择 3 种自发荧光弱的棉花材料 GZ-2，Y-2067 和ZA-23，收集 3 种材料的花粉，将金粉包裹好的 pBI121-GhVP∷GFP 质粒加入基因枪 GDS-80，轰击棉花花粉，在激光共聚焦显微镜下（目镜 40×）观察单个花粉颗粒，结果（图4）与前期研究结果相一致，3 种花粉的绿色荧光都明显增强，证明 GhVP 基因在棉花花粉中得到了表达。这为 GhVP 基因在棉花中表达研究和下一步转基因试验提供了理论基础。

GhVP 基因在棉花中的组织特异性表达

分析荧光定量结果（图5）显示，GhVP 基因在棉花根、叶、茎、花和纤维中均表达，而且表达差异较大。以根部的表达量为对照，可以看出 GhVP 基因在叶片中的表达量最高，是根部表达量的 3～4 倍，茎中的表达量是根部的 2 倍，而 GhVP 基因在花和纤维中的表达量相对较低。说明 GhVP 基因主要在棉花叶片中表达，并发挥功能，具有不同组织优势表达的特性。

结论

本研究从棉花中成功克隆得到 GhVP 基因，构建 pBI121-GhVP∷GFP 荧光表达载体。亚细胞定位结果显示，GhVP 主要位于细胞质膜上。同时构建 pBI121-GhVP∷GFP 荧光表达载体转化棉花花粉，结果花粉的绿色荧光增强，表明该基因表达量增加。同时对该基因在棉花不同组织（根、茎、叶、花和纤维）中的表达量差异进行分析。结果显示该基因在叶片中表达量最高，在纤维中最低，具有表达组织特异性，该结果也暗示VP 基因主要发挥作用的位置不同，与基因功能密切相关。

V-PPase 是 1 类离子转运酶。自从在 1975 年从甜菜中提取到 VPP 以来，已经相继从多种不同植物中克隆得到了 VPP 基因。目前对 VPP 基因的功能及转基因分析都做了许多研究，然而 VPP 基因在棉花中的具体功能还需进一步深入研究。将外源基因转入受体植物体内，是遗传学上研究基因功能和获得遗传修饰新功能的重要手段。农杆菌介导法是目前最常用的方法之一，但是此方法的转化效率不高，且费时费力。本研究采用棉花花粉进行瞬时表达研究，可以缩短周期，更快速获得转化植株，为基因功能的研究开辟了新思路。本研究基于棉花焦磷酸酶基因 GhVP 的亚细胞定位和瞬时表达研究，结合该基因在不同组织中的表达差异分析，表明 GhVP 基因主要在叶片的细胞质膜上发挥作用，可能与棉花抗逆胁迫有重要关系。同时也为棉花花粉的瞬时表达研究提供了依据，为进一步进行基因功能的研究开辟了新思路。

参考资料

赵小洁, 穆敏, 陆许可,等. 棉花耐盐相关基因GhVP的表达及功能分析[J]. 棉花学报, 2016, 28(2):122-128.