植物体内游离脯氨酸含量的测定

实验概要

掌握小麦叶片内游离脯氨酸含量的测定方法。

实验原理

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的  疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止 渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。  因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用， 而且即使在含 水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，  植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定  程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

主要试剂

3%磺基水杨酸水溶液
甲苯
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效
脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液  

主要设备

分光光度计
水浴锅
漏斗
20ml大试管数支
20ml具塞刻度试管9支
5～10ml注射器或滴管

实验材料

小麦叶片

实验步骤

1．标准曲线制作
表1  各试管中试剂加入量

  （1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。   （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。   （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。
2．样品测定   （1）脯氨酸提取  取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。   （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。   （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。
脯氨酸（μg/g FW或DW）= (C*(V/a)) / W
式中  C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）； W—样品重（g）。
 

注意事项

质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题：
1. 取材的一致性，代表性；
2. 器皿和用具要清洁；
3. 测试条件要一致，如测试温度等要一致；
4. 注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。