植物学技术：细胞伤口愈合实验

原理：

细胞伤口愈合实验被研究者广泛应用和改进，用来研究各种实验条件比如基因敲除和化疗在细胞迁移和增殖中的作用。该实验操作简单，费用廉价，实验条件容易根据不同的目的改进。该方法的基本原理是，在单层培养细胞间制作划痕以产生愈伤区域，然后监控该伤口周围细胞的向划痕迁移的现象，即伤口愈合。改变细胞迁移和/或生长的因素可以增加或降低伤口愈合率。该方法可以定量，适用于自动化系统高通量筛选。

材料和仪器：

1.人MDA-MB-231cell(ATCC#HTB-26)

2.DMEM培养基(Invitrogen#10313-021)

3.胎牛血清(ATCC#30-2020)

4.PBS(Invitrogen#14190-144)

5.BD24孔细胞培养板(Fisher#08-772-1H;BD#353226)

6.Raininpipettips,1ml(Rainin#GPS-L1000)

7.戊二醛(Sigma-Aldrich#G6257)

8.乙醇(Sigma-Aldrich#459836)

9.结晶紫(Sigma-AldrichC3886)

10.细胞培养仪：37°Cand5%CO2

步骤：

1.细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。

2.细胞以一定密度接种到24孔细胞培养板中，生长24小时后，单层细胞融合度应达到70-80%。

3.不要更换培养基。用新的1ml枪头轻轻的在单层培养细胞间划痕，划痕横穿过孔，枪头尽量与板孔的底部垂直，不要倾斜。这样产生的gap的距离才与枪头末端的外直径相等。Gap的距离可以选用不同型号的枪头调节。划痕在同一方向成一条直线。

4.在垂直与*条划痕的方向制作另一条划痕，每孔划痕成十字交叉型。

5.划痕后，用培养基轻轻的清洗板孔2次，以去除脱落细胞。

6.每孔添加新鲜培养基。

7.(培养基中含有某些成分，如抑制/促进细胞迁移和/或增殖的化学物质)

8.细胞生长48小时(或根据时间需要).

9.1xPBS清洗细胞两次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分钟。

10.10.1%的结晶紫（2%乙醇溶解）染色30分钟。

11.染色的单层细胞选取不同的视野，显微镜拍照。gap的距离可通过Photoshop或ImagJ软件测量.为了降低实验结果的可变性，建议每孔选择多个视野观察，每组做多个重复。