植物激素类物质的生理效应及生物鉴定

生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸是公认的五大类植物激素，它们对植物都有其独特的生理效应。在植物激素的早期研究中，多以其生物效应作为定量测定及鉴定的方法。随着免疫学方法、分光光谱法及色谱法等新技术的发展，生物鉴定法已很少用于植物激素的研究，但这些实验技术对于了解植物激素的特性仍有重要意义。

一、生长素类物质对根、芽生长的影响

【原理】

生长素及人工合成的类似物质，如萘乙酸等一般在低浓度下对植物生长有促进作用，高浓度则起抑制作用。根对生长素较敏感，促进和抑制其生长的浓度均比芽低些。根据此原理可观测不同浓度的萘乙酸对不同部位生长的促进和抑制作用。

【仪器与用具】

恒温培养箱；直径7CM的培养皿7套，吸量管10Ml 2支，1Ml 1支；圆形滤纸（直径与培养皿底内径相同）7张；尖头镊子1把，记号笔1支。

【试剂】

10Mg／L萘乙酸（NAA）溶液：称取萘乙酸10Mg，先溶于少量乙醇中，再用蒸馏水定容至100Ml，配成100Mg／L萘乙酸溶液，将此液贮于冰箱中，用时稀释10倍。漂白粉适量。

【方法】

1将培养皿洗净烘干，编号，在1号培养皿中加入已配好的10Mg／L NAA溶液10Ml，在2～6号培养皿中各加入9Ml蒸馏水，然后用吸管从1号皿中吸取10Mg／L NAA溶液1Ml注入2号皿中，充分混匀后即成1Mg／L NAA。再从2号皿吸1Ml注入2号皿中，混匀即成01Mg／L溶液，如此继续稀释至6号皿，结果从1号到6号培养皿NAA浓度依次为10mg/L、10mg/L、01mg/L、001mg/L、0001mg/L、00001Mg／L。zui后从6号皿中吸出1Ml弃去，各皿均为9Ml溶液。7号皿加蒸馏水9Ml作为对照。

NAA浓度

（mg/L）根数/粒平均各条根长（cm）*条种子根第二种种子根第三条种子根平均芽长

（cm）2精选小麦种子约200粒左右，用饱和漂白粉上清液表面灭菌20Min，取出用自来水冲净，再用蒸馏水冲洗三次，用滤纸吸干种子表面水分。在1～7号培养皿中各放一张滤纸，沿培养皿周缘整齐地摆放20粒种子，使胚朝向培养皿中心，加盖后置20～25℃温箱中，24～36H后，观察种子萌发情况，留下发芽整齐的种子10粒。3天后，测定各处理种子的根数、根长及芽长，求其平均值，记入表15-1，确定NAA对根、芽生长具有促进或抑制作用的浓度。
 

二、生长素的生物鉴定——芽鞘伸长法

【原理】

生长素能促进禾本科植物胚芽鞘的伸长。切去顶端的胚芽鞘段，断绝了内源生长素的来源，其伸长在一定范围内与外加生长素浓度的对数呈线性关系。因此，可以用一系列已知浓度的生长素溶液培养芽鞘切段，绘制成生长素浓度与芽鞘伸长的关系曲线，以鉴定未知样品的生长素含量。

【仪器与用具】

恒温箱；搪瓷盘（带盖）1个；贴有毫米方格纸的玻璃板1块；吸量管10Ml 1支，1Ml1支；镊子1把；绿色灯泡1个；培养皿（直径7CM）5套；记号笔1支；细玻璃丝若干；简易切割刀（用有机玻璃和两片双面刀片制成，两刀片间距6MM）。

【试剂】

漂白粉适量；

含有2％蔗糖的磷酸—柠檬酸缓冲液（PH50）：称取K2HPO4 1794g，柠檬酸1019g，蔗糖20g，溶于蒸馏水中定容至1L；

吲哚乙酸（IAA）溶液：称取175Mg IAA，用上述缓冲液溶解并定容至100Ml，为0001Mol／L的IAA溶液。

【方法】

1精选燕麦（或小麦）种子100粒，浸入饱和的漂白粉溶液中20Min，取出后用自来水和蒸馏水洗净，成横排摆放在铺有洁净滤纸的带盖搪瓷盘中。为了使胚芽鞘基部无弯曲，需将搪瓷盘斜放成40°～50°角，使胚倾斜向下，盘中加水并加盖，置25℃暗室中培养。暗室以绿色灯泡照明。

2播后3天，当胚芽鞘长度为25～35MM时，精选芽鞘长度一致的幼苗50株，用镊子从基部取下芽鞘，再用切割器在贴有方格纸的玻璃板上切去芽鞘顶端3MM，再向下切取6MM的切段50段，放入蔗糖磷酸缓冲液中浸泡1～2H，以洗去内源生长素。

3取洗净烘干的培养皿5套，用记号笔编号，向各皿内加PH50的蔗糖磷酸缓冲液9Ml，然后在1号皿中加0001Mol／L的IAA缓冲液1Ml，摇匀，即成10－4Mol／L的IAA溶液；再从1号皿中吸出1Ml注入2号皿，摇匀，即成10－5Mol／L IAA溶液；再从1号皿中吸出1Ml注入3号皿，摇匀，即成10－6Mol／LIAA溶液；依次操作到4号皿，配成10－7Mol／L IAA溶液，并吸出1Ml弃去。5号皿不加IAA作对照。

4从缓冲液中取出胚芽鞘切段，吸去表面水分，将切段套在玻璃丝上，注意仔细操作，勿损伤芽鞘。同一玻璃丝上可以穿2～3段芽鞘，但要留下生长的空隙。每一皿中放入10段芽鞘，加盖，在25℃暗箱或暗室中培养。以上操作应在绿光下进行。

5培养24H后，取出芽鞘，在毫米方格纸上测量其长度，若能借助于双目解剖镜则可提高测量精度。求出每种处理的芽鞘平均长度。以处理芽鞘长度（L）与对照长度（L0）之比（L／L0）为纵坐标，以IAA浓度的对数为横坐标画出标准曲线。

6对于未知浓度的生长素提取液或其他类似物溶液，均可按上述步骤求L／L0，查出标准曲线即可求得其浓度或效价。
 

三、细胞分裂素的生物鉴定——萝卜子叶增重法

【原理】

细胞分裂素有促进萝卜子叶增大（鲜重增加）的效应。可先做出细胞分裂素浓度与子叶重量增加的关系曲线，再以待测样品进行对比试验，就可鉴定样品中细胞分裂素的浓度或效价。

【仪器与用具】

培养皿（直径9CM）5套；圆形滤纸5张；搪瓷盘（带盖）1个；镊子1把；手术剪1把。

【试剂】

漂白粉适量；5Mg／L激动素或6-BA溶液。

【方法】

1种子萌发取均匀一致的萝卜种子200粒，用饱和漂白粉溶液消毒20Min并洗净，摆放在垫有滤纸并用蒸馏水湿润过的带盖搪瓷盘中，25℃暗中催芽。约30H后，即萌发而展开一大一小两片子叶。从每个幼苗上切下较小的一片子叶，注意子叶上不能残留下胚轴。选择大小一致的子叶50片供试。

2.子叶培养取直径9CM的培养皿5套编号，并在各培养皿垫一张与皿底大小相同的滤纸，从1号至5号培养皿分别加50、05、005、0005Mg／L的激动素或6-BA水溶液和蒸馏水各3Ml。溶液稀释方法同IAA（见本实验项目二），在各个培养皿的滤纸上放10片子叶，盖好皿盖，并把培养皿放在垫有湿润滤纸的搪瓷盘上，用玻璃板将盘子盖好，以维持高湿度，在荧光灯下25℃培养3天，用分析天平称每个子叶鲜重，求其平均数。

3.以每一处理的子叶平均重为纵坐标，激动素或6-BA浓度的对数为横坐标，绘出两者的关系曲线。用同样方法以未知样品溶液培养萝卜子叶，与标准曲线比较，即能大致确定未知样品细胞分裂素的含量或生物效价。
 

四、赤霉素的生物鉴定——水稻幼苗法

【原理】

赤霉素能强烈促进水稻幼苗叶片伸长，幼苗株高在一定范围内同外加赤霉素浓度的对数呈直线关系。因此可用作生物鉴定方法以测定未知样品的赤霉素含量或效价。

【仪器与用具】

培养皿（直径9CM）1套；镊子1把；100Ml高型烧杯12只；吸量管（2Ml）6支。

【试剂】

漂白粉适量；100Mg／L赤霉素溶液。

【方法】

1粒选水稻种子100～200粒，用饱和漂白粉溶液灭菌20～30Min，再用冷开水充分洗净，放在铺有洁净滤纸的培养皿中加冷开水至约浸没种子厚度的一半，放在25～29℃的室内催芽。4～5天后，精选芽长5MM、高度一致的幼苗60株待用。

2取100Ml高型烧杯12只，每2只为一组，共分6组，按组依次加入蒸馏水、01Mg／L、10Mg／L、10Mg／L、100Mg／L标准赤霉素溶液各2Ml，第六组加入2Ml待测液（待测样品的赤霉素浓度如果很高，应根据估计的浓度范围适当稀释，使稀释液的赤霉素浓度在05～50Mg／L范围内）。然后在每一烧杯中放入5株水稻幼苗，烧杯上覆盖培养皿盖，放置在27℃左右的散射光下（或日光灯照明下）培养，培养期间可适当补充蒸发掉的水分。当苗高与烧杯高度相近时，将培养皿盖除去。

35～6天后，当对照的第三片叶子开始伸出时用米尺测量各幼苗第二叶的叶鞘长度，求出平均值，以叶鞘长度为纵坐标，赤霉素浓度的对数为横坐标作图，画出标准曲线，将未知样品培养的稻苗第二叶鞘长度与标准曲线相比，可大体确定未知样品赤霉素的浓度和效价。