植物组织培养中常用灭菌方法（一）

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

1、培养基用湿热灭菌
培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1mpa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05mpa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

关阀再通电后，压力表上升达到0.1mpa时，开始计时，维持压力0.1-0.15mpa，20分钟。
按容器大小不同，保压时间有所不同。见表1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。

表1. 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间

到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5mpa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。

对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。

对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭局20-30分钟。
高压灭菌前后的培养基，其ph值下降0.2-0.3单位。高压后培养基ph值的变化方向和幅度取决于多种因素。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的ph值变化幅度较大，甚至可大于2个ph值单位。环境ph值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。

高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。

培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。

为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：
（1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。
（2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意ph值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
（4）注意高压灭菌后培养基ph值的变化及恢复动态。如高压灭菌后的ph值常由5.8升高至6.48。而96小时后又会降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。

2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌

在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。