植物组织mRNA的提取方法

实验概要

本实验介绍了植物组织mRNA的提取方法。

实验原理

由于mRNA末端含有多poly（A） ,当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

主要试剂

1. 0.1mol/L NaOH

2. 3M NaAc（pH5.2）

3. 70%乙醇

主要设备

1. 巴斯德吸管

2. 高压灭菌锅

3. 65℃水浴锅

4. 高速离心机

实验材料

提取的RNA液。

实验步骤

1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo（dT）纤维素。

2. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3. 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4. 将提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

5. 测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6. 测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

7. 加入1/10体积的3M NaAc（pH5.2），2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

8. 4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

9. 小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

10. 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

注意事项

1. mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2. oligo（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。