植物细胞骨架的显示及光镜观察

实验概要

植物细胞骨架的显示及光镜观察

实验原理

 细胞内由微丝、微管、中间纤维等交织形成一个十分复杂的立体网络结构。它们对于细胞形状的保持、细胞内物质运输、细胞运动、细胞内各结构相对位置的固定都有重要作用，故而称为细胞骨架。
 

     
细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、高压、酸处理等。当采用适当的手段，如M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛在室温下固定能较好的保存细胞骨架的成分，另外，Triton X-100处理能抽取掉一部分 杂蛋白，可使骨架成分显现的更加清晰。
 

     
微丝、微管、中间纤维等都是直径很小的结构。最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下才能看见，目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微技术，本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布，结构经染色以后，有夸大作用。由于细胞经Triton X-100提取剩下的主要成分是细胞骨架成分，使得显现等价清晰。

主要试剂

M-缓冲液（配制方法如下）：

        咪唑              2.90g

        KCl               3.70g              MgCl2            0.012g

        EGTA             0.38g               EDTA            0.042g

      巯基乙醇     0.086ml        加水到          1000 ml                  

6mM磷酸缓冲液

        KH2PO4                         0.74g 

        Na2HPO4•12H2O            2.4g

        加水到                   1000 ml

　　　　    
１％Triton X-100：以M-缓冲液配制

　　　    
３％戊二醛： 25％戊二醛  12 ml   6nm磷酸缓冲液   88 ml  
               
染料： 考马斯亮蓝 R-250     0.2g     冰醋酸        7 ml                                                
甲醇                              46.5 ml     蒸馏水             46.5 ml

主要设备

   器材：显微镜、烧杯、吸管、镊子、载片、盖片

实验材料

   材料：洋葱鳞茎

实验步骤

１.撕取洋葱鳞茎内表皮表皮细胞（约1cm2）若干片置于盛有6mH  pH6.8磷酸缓冲液中，使其下沉。
 

２.吸去磷酸缓冲液，加入１％Triton X-100处理２０－３０分钟
。

３.吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗三次，每次三分钟。
 

４.３％戊二醛固定３０－６０分钟。
 

５.pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次十分钟。
 

６.0.2%考马斯亮蓝 R-250染色20-30分钟。
 

７.用蒸馏水洗1-2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察，就可以看到由微丝、微管组成的网络。