植物自交不亲和性测定技术

自交不亲和性在白菜、甘蓝等十字花科蔬菜中是普遍存在的，其遗传机制也较相似。自交不亲和株正开放花的柱头上，如果授于同株或同系统的花粉时，柱头就被激发产生胼胝质等物质，阻碍花粉发芽和花粉管发育，故不能正常受精结实，不结子或结少量种子；而授于别的品种或系统的花粉时，则柱头不会被激发产生这类物质，故能正常受精结实。可是，在花蕾柱头上，即使授于同株或同系统的花粉也不会被激发这种反应，因此可通过蕾期人工控制自交获得自交不亲和系的种子。
胼胝质是β－1、3－葡聚糖，通常分布于高等植物的筛管、新形成的细胞壁、花粉粒以及花粉管中，将其用苯胺蓝染色后，在紫外光激发下，可发出黄至黄绿色的荧光。因此，把授粉后经用苯胺染色的子房放到荧光显微镜  下观察，可看到花粉在柱头上萌发、花粉管发育的状态，以及胼胝质在柱头表面的沉积状况等，进行判断花粉与柱头是否亲和。
实验目的是学习花期人工控制自交测定选择自交不亲和系和蕾期自交繁殖自交不亲和系的方法；掌握用荧光显微镜检测植物  的自交不亲和性技术；通过本实验加深对自交不亲和系选育过程的理解。

一、试材及用具
1．试材：白菜、甘蓝、萝卜等十字花科正开花的种株。
2．用具：荧光显微镜、广口瓶（20～50ml）、载玻片、盖玻片、镊子、铅笔、纸牌、纸袋、细铁丝、细竹竿、脱脂棉、甲醛、冰醋酸、无水酒精、普通酒精、磷酸钾、苯胺蓝、氢氧化钠、甘油、蒸馏水等。
二、方法步骤
（一）人工自交测定法
1．每人选3～5株发育健壮已开花的种株，每株上选3～4个花序。将其上已开的花和角果摘除，然后套上隔离纸袋，把袋口用细铁丝扎紧防止昆虫进入，于植株旁插一细竹竿，用绳把纸袋绑到细竹竿上保持固定，防止花序被风吹断，并在竹竿上挂一纸牌作标记。
2．2～3d以后，当每个花序上有10朵左右花开放时，解除纸袋，将已开的花和蕾之间绑一条线作为区分标记，同时在每个花序上选择10个左右大蕾，把其余的小蕾用镊子去掉，并用镊子把花蕾顶端的花被去掉一部分使柱头露出，切勿伤害柱头。再用镊子摘取本株隔离袋内已开花的花药，把花粉同时抹到已开的花和破蕾的柱头上，进行人工花期和蕾期自交。授粉完毕，于每个花序下面挂上纸牌，注明花期自交花数，蕾期自交蕾数，授粉者姓名和授粉日期。最后用纸袋按原来的套袋隔离方法进行套袋隔离。
3．授粉2～3d后要及时提袋，防止花序于袋内顶弯或折断。在暴风雨后，要及时检查，如发现被风吹雨打破裂的隔离袋要及时修补或更换，被风吹倒了的植株要轻轻扶起来加以重新固定，切防折断。
4．在授粉后7～10d花瓣脱落之后，可将隔离袋摘除，去掉多余花枝及后来陆续抽出的花枝，确保花序的发育。以后除按一般种株管理之外，应特别注意防止蚜虫、霜霉病等病虫害。
5．当角果变黄后，可把角果带花枝剪下装入纸袋，拿到室内风干考种（表1－5）。


（二）荧光鉴定法
1．预先配制几种试剂
（1）FAA固定液：将40%甲醛、80％酒精和冰醋酸，按1:8:1的比例配制而成。
（2）卡诺固定液：用3份无水酒精和一份冰醋酸配制而成。
（3）0.1N磷酸钾水溶液：称取71g磷酸钾，用蒸馏水定容至1000ml。
（4）0.1%苯胺蓝溶液：称取0.1g水溶性苯胺蓝，用0.1N磷酸钾水溶液定容至100ml。
（5）8N氢氧化钠溶液：称取32g氢氧化钠，用蒸馏水定容至100ml。
2．取样、固定和保存
解开人工控制自交授粉6～12h的花枝上的纸袋，摘取子房，于花柱基部切下花柱，将花期授粉和蕾期授粉的花柱分别固定于FAA固定液或卡诺固定液中，24h后，转移到70%酒精溶液中保存。在瓶上注明株号、花期授粉还是蕾期授粉处理以及试验者姓名。
3．透明和软化
将上述固定材料用水冲洗后，转移到指形管中，用8N氢氧化钠浸泡8～24h。
4．染色
把软化后的试材用自来水多次换水浸泡1h以上，除去大部分氢氧化钠之后，转移到0.1%苯胺蓝染液中染色4h左右。
5．观察
用镊子挑取一枚染色后的花柱，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开。然后把载玻片放到荧光显微镜下，观察记载每株柱头胼胝质沉积状况，花粉萌发及花粉管生长状态。

三、作业思考题
1．按照上表中的数据资料，统计每株的亲和指数，即亲和指数＝每株结籽粒数/每株花期自交花数，并将资料进行合理分析。
2．根据花期自交和蕾期自交柱头胼胝质沉积情况以及花粉管生长状况，判断取样株自交亲和与否，绘出亲和株和不亲和株花粉发芽以及生长状态图。
3．本实验采用的第一种方法中，有哪些技术环节使可以变化的？
4．花期人工控制自交测定自交不亲和性产生误差的原因有哪些？