植物花粉母细胞减数分裂制片实验

实验方法原理：

减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次的细胞分裂，第一次分裂是减数的，第二次是等数的。第一次分裂的前期较长，染色体变化较复杂，可细分为5个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。染色体在减数分裂的行为对遗传物质的分配和重组产生重大影响。

高等植物在形成雄配子的过程中，花药内的小孢子母细胞（2n），经过减数分裂最终产生四个小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。由于植物花药取材容易，操作方便，一般作为减数分裂制片材料。在适宜的时期采集植物的花蕾，经固定液杀死固定，使细胞保持活体时形态。然后进行压片染色等处理，制成减数分裂玻片标本，在显微镜下进行观察，可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程（即染色体由双倍变为单倍体的过程），研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。

实验材料：玉米雄花序   

试剂、试剂盒：

无水乙醇                                                                 

95%乙醇                                                                  

重铬酸钾                                                                  

浓盐酸                                                                  

浓硫酸                                                                 

冰醋酸                                                                  

二甲苯                                                                  

加拿大树胶                                                                  

洋红  

仪器、耗材：

显微镜                                                                  

解剖针                                                                 

载玻片                                                                  

盖玻片                                                                  

镊子                                                                  

培养皿                                                                  

酒精灯                                                                  

吸水纸                                                                 

纱布                                                                  

刀片                                                                 

滤纸                                                                  

火柴

实验步骤：

1．取材：选取适当大小的花蕾，是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时期不同。

玉米：在抽雄前两周左右（大喇叭口期），用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘，触到有松软感处，即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口，用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗颖长4mm左右，花药长2～3mm，每一分枝中上部小穗发育最早。

取材时间一般在上午9时～10时，不同材料间稍有差异。

2．固定：取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在4～15℃条件下，一般固定时间为24小时。固定后的材料先用95%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到70%酒精中置于冰箱内保存。常用的固定液是法氏固定液，在使用这种固定液时应注意现配现用，固定时不要在阳光下暴晒。

3．染色和压片：先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精，然后放在载玻片中央。用解剖针挑出2～3个花药，并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上。用解剖针将花药横向切断，并从一端向切口轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的关键步骤之一，如不去净残渣，则不容易把分裂的细胞压平，使染色体不容易分散开，并且在制作永久片的过程中，细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后，在低倍镜下进行初步镜检，如果花粉母细胞处于减数分裂时期，即可加上盖玻片。加盖玻片时，先使盖玻片的一边放在载玻片上，待染液布满整个边缘时，左手握镊子顶住盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下。加上盖玻片以后，如有多余染色液，可用吸水纸吸去；如染色液不能布满盖玻片，则在盖玻片一边稍加染色液，然后在酒精灯上烤片。烤片时，用手平持片子在酒精灯上方来回移动，并经常将片子放在手背上试温，以片子不烫手为宜，可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通过烤片可使细胞质颜色变浅，而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块吸水纸，以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染色太浅，可在盖玻片周围稍加染色液再烤；如果染色太深，可从盖玻片一边滴加45%冰醋酸，在另一边用吸水纸吸，让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。

4．制作永久片：要使片子能长期保存应用，可制成永久片。永久片的制作主要包括分片，脱水透时和封片三个步骤。首先用培养皿（内置U型玻璃管或一根短玻棒）若干套编号，配制多级脱水剂（常用脱水剂见附录二）。

（1）分片：准备制成永久片，首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接触，使盖玻片自然脱落，并标记载玻片和盖玻片原来相对应的方向和位置。

（2）脱水透明：用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片（方向不变，材料朝上），放入第二级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水，一般每级约1～2分钟。如用第三种脱水剂每级约20～30秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落，在制片时可先在盖玻片上涂一层蛋白甘油胶，在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后，稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。

（3）封片：片子从最后一级培养皿内取出后稍凉，于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一滴完整的加拿大树胶，然后翻转盖玻片（使有材料的一面朝下），按原来的方向和位置轻轻盖在树胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉，不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干再镜检。对于镜检符合要求的片子，在载玻片右端贴上标签，注明标本名称，制片日期。

[附]冷冻分片法：这种方法快速简单。对准备制作永久片的玻片，先用液态二氧化碳干冰冷冻，或用冰冻致冷器进行冷冻，待完全冷冻结冰后，用刀片将盖玻片同载玻片分开，将载玻片和盖玻片放在37℃左右的温箱内烘干。取出后放在二甲苯内浸泡10～20分钟，滴加树胶封片即可。