植物茎尖培养

（一）实践目的

通过实践学习和练习，掌握植物茎尖培养基本技术。

（二）实践用具与材料

超净工作台、18cm手术弯剪、16cm镊子、接种盘、毛刷、纱布、培养瓶。培养基250瓶、洗衣粉1袋、2%新洁尔灭500mL、75%酒精4L、0.1%升汞1L、无菌水。带嫩芽的植物枝条

（三）实践时间与场地

4学时、植物组培室

（四）实践内容

1、外植体的选取及预处理

⑴外植体选取

选取生长健壮、已发芽、长势较好、无病害的生姜根状茎作为外植体。

⑵材料预处理

取带芽的枝条或鳞茎球茎，洗衣粉适量冲洗，然后扳取或用清洁剪刀剪取带芽部位（约1cm×1cm大小），顶芽和腋芽、大芽和小芽分开。继续用洗衣粉清洗10分钟，清洗时需不停晃动。再用自来水冲洗干净，置空培养瓶备用。

2、超净工作台无菌操作准备

检查超净工作台，是否已开机灭菌，酒精灯、酒精瓶、升汞是否齐备、无菌水、培养瓶放置与位置、接种器械是否齐备与放置。

3、外植体消毒

⑴蒸馏水冲洗

外植体置于已杀菌开机的超净工作台上，新洁尔灭洗液消毒双手，无菌蒸馏水清洗外植体2-3次，需随时晃动。

⑵酒精消毒

75%酒精倒入装外植体的容器内，消毒外植体5-60s，时间长短视植物材料情况而定，一般幼嫩材料和室内带菌培养材料消毒时间短，老材料或室外材料消毒时间长。动作一定迅速，需晃动，然后将酒精倒去。整个时间计算以酒精倾倒开始至酒精倒出瓶外为止，

⑶升汞消毒

1%生汞倒入装外植体的容器内，消毒外植体5-10min，时间长短视情况而定。需晃动，在最后3min静置，升汞注满容器，将已灼烧的镊子放入容器升汞内浸泡。

10%次氯酸钠溶液倒入装外植体的容器内，消毒外植体10-12min，时间长短视情况而定。

⑷蒸馏水清洗

用镊子将外植体取出，放入另一无菌蒸馏水瓶中清洗，反复清洗4次。

4、材料的整理

用灼烧冷却的镊子和剪刀对外植体进行处理，剥离外植体材料芽外部小叶片，露出尖端生长点和2-3片叶原基部分，将此部分剪下做培养材料。再用无菌蒸馏水清洗3-4次。

5、接入培养基

培养基瓶放入工作台内，将剥离的材料分别用消毒过的镊子放入培养瓶内，盖上瓶盖，置培养篮内，写上培养时间、操作人及培养品名，入培养室培养。

6、整理工作

清洁整理超净工作台和实验室。

（五）实践指导

1、操作中严格有菌观念、无菌操作。

2、操作前一定先换上工作服、专用鞋、清洁双手。

3、超净工作台工作前，检查工作台是否开启紫外灯和风机，酒精灯、消毒器械的酒精、消毒液是否准备齐备。蒸馏水、培养基是否齐备。

4、工作时培养基、蒸馏水、消毒液等放置齐整，器械取出后放入消毒液里，用过的溶液、线和报纸放在工作台外。

5、接种工具不能碰触瓶口和工作台其它部位，手不能碰触瓶口，更不能伸入瓶内，不能碰触材料。

6、无菌水和酒精、升汞处理材料时需不断晃动，便于材料与液体充分接触。

7、酒精、升汞处理材料时间必须适宜，时间短消毒效果不理想，时间长会将材料杀死。

8、操作细致，水不要洒在工作台上，掉落在台面的材料不能再用。

9、操作完毕，须在瓶上注明日期、操作人，便于观察。

10、有些同学器械放置很乱，整个超净工作台面乱七八糟，影响效果。