植物蛋白质组学和糖基化实验（二）

刀豆球蛋白 A (ConA)- 过氧化物酶方法（根据参考文献 20 修改的方法)。

( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。

( 2 ) 用 TTBS 缓冲液浸泡印迹膜 1 h。

( 3 ) 将印迹膜在含有 ConA ( 25 μg/ml）的 TTBS 缓冲液中，室温下温育 2 h。

( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 将膜放置在含辣根过氧化物酶（HRP，50 μg/mL) 的 TTBS 缓冲液中，室温下温育 1 h。

( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min)，显影前在 TBS 溶液中漂洗一次。

( 7 ) 过氧化物酶的显影作用与凝集素-生物素/链霉亲和素-辣根过氧化物酶方法中的相同。

( 8 ) 实验必须设对照，见注释 4。

2 ) 特异性抗体的免疫检测方法

我们已经报道了植物 N-复合糖苷的 β-1-2 木糖和 α-1-3-岩藻糖抗原表位在兔子血清中具有高免疫 [21] 。因此，含复合糖苷的糖蛋白抗血清往往含有抗 β-1-2 戊醛糖和 α-1-3 海藻糖的抗体。一些商业免疫血清与我们自制的探针具有相同的特性。如抗 HRP 的免疫血清可用作植物含有 α-1-3 岩藻糖和 β-1-2 木糖残基的复合 N-糖苷的特异性探针。从蜂毒蛋白中获得的免疫血清具有更强的特异性，可用作含 α-1-3 岩藻糖的植物复合糖苷的特异性探针[ 21] 。我们在实验室，从兔血清中获得了对复合型糖苷末端天线（三糖 Lewisa ) 的特异性兔抗体 [22] 。抗 Lewis  a 的单克隆抗体已商业化，但其非常昂贵。

阿拉伯半乳糖蛋白（AGP ) 和伸展蛋白可用商业单克隆抗体检测（http://W W W . plantprobes.co.uk/) 。我们实验室没有使用过这些抗体，请参考描述这些抗体特异性的原始论文（见注释 5) 。

( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。

( 2 ) 用 含 3% 明胶的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 1 h。

( 3 ) 用 含 1% 明胶和适宜稀释浓度的免疫血清的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 2 h。我们使用的 25. 2.2 节 1.2 ) 中提到的商业免疫血清，稀释方法如下：

a. 兔抗 HRP 免疫血清，1 : 300。

b. 兔抗蜂毒蛋白免疫血清，1 : 200。

c. 鼠抗 Lewis 单克隆抗体，1 : 100。

( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 用 含 1% 明胶和适当的标记抗体的 TBS 缓冲液，室温下浸泡印迹膜 1 h。标记抗体可为 1 : 2000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG (G 型免疫球蛋白）抗体，或 1 : 500 稀释的 HRP 标记羊抗鼠多价免疫球蛋白抗体。

( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min) ，显影前在 TBS 溶液中漂洗—次。

( 7 ) 过氧化物酶的显影作用与凝集素-生物素/辣根过氧化物酶方法中的相同（ 见 25.3.2 节 1.1)。

( 8 ) 对照见注释 6 和注释 7。

2. 糖苷单糖组分的分析

糖苷单糖组分的分析是通过用甲醇-HCl 溶液水解糖蛋白，然后用气相色谱鉴定和分析单糖产物及其衍生物。单糖组分分析结果提供了连接到糖蛋白和/或 N-连寡聚糖）上的糖苷类型的初步数据。

( 1 ) 将 1 mg 纯化的蛋白质样品放入带聚四氟乙烯涂层的螺旋盖子的玻璃管中，进行冻干处理（见注释 8) 。

( 2 ) 向待测蛋白质样品中加入 5~10 μl 的 2 mmol/L 肌醇贮藏液（见注释 9) 。甲醇分解反应之前再次冻干处理样品。

( 3 ) 在蛋白样品中加入 500 μl 浓度为 1 mol/L 甲醇-HCl 溶液，旋紧盖子，置于 80°C 加热过夜。

( 4 ) 甲醇分解反应后的样品在氮气保护下，40°C 加热干燥处理样品。注意：因甲醇有毒，应在通风橱中操作。

( 5 ) 用 250 μl 甲醇漂洗，如步骤（4 ) 的操作，在氮气环境下干燥处理样品，重复漂洗步骤两次。

( 6 ) 用 250 μl 甲醇重悬样品，接着加入 25 μl 的乙酸，25 μl 吡啶，匀浆，在室温下放置 6 h，如步骤（4 ) 的操作，在氮气环境下干燥处理样品。

( 7 ) 加入 250 μl 的硅烷化试剂，80°C 温育 20 min ( 见注释1) ，空气吹干样品。

( 8 ) 用 1 ml 环己烷冲洗，空气吹干，并重悬于 200 μl 环己烷中，匀浆，离心，将 100 μl 衍生物样品转移到带盖的反应小瓶中。

( 9 ) 设置气相色谱仪的氦气压强设为 1.4 bar，注入样品前要将注射器和 FID 检测器分别加热到 250°C 和 280°C 。设置氦气的压力为 20 psi，流速为 3 ml/min。在注入 5 μl 的衍生物样品（相当于 25 μg 蛋白质）之前，平衡色谱柱的温度到 120°C。温度梯度洗脱单糖衍生物：① 每分钟升高 10~160°C。② 每分钟升高 1.5~235°C。③ 235°C 4 min。 ④ 每分钟升高 20~280°C。⑤ 280°C  3 min。