实验概要
本实验介绍了一种构建植物表达载体的方法。
实验步骤
1. 植物正义表达载体的构建
1) 用SmaI和SacI双酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表达载体pBI121:
2) 进行琼脂糖凝胶电泳,回收GhMT3a片段和pBI121载体;
3) 连接:连接体系为:
混匀后4-160C连接过夜;
5) 转化:取5ul连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,菌液涂布于含卡那霉素的固体LB平板上;
6) 重组子的筛选:对长出的菌落进行PCR及酶切鉴定。
2. 农杆菌感受态细胞制备及转化
感受态细胞的制备:
1) 挑取农杆菌GV3101单菌落,接种于5m1LB液体培养基中,28℃,过夜培养;
2) 取2 ml培养物至液体LB中,继续培养至OD600为0.5左右;
3) 将培养物冰浴30 min,4℃,5000 rpm,离心5 min;
4) 弃上清,10 ml 0.1 M冷NaCl悬浮菌体,4℃,5000rpm,离心5 min;
5) 弃上清,1 ml 20 mM冷CaCl2悬浮,分装成200ul/管,液氮中冷冻后-80℃保存。
冻融法转化农杆菌:
1) 冰上融化感受态细胞,加入1-2ul重组质粒DNA,冰浴45 min,液氮中冷冻1 min再37℃水浴5 min;
2) 加入1 ml无抗生素的LB,28℃,200 rpm,3 h;
3) 12000 rpm,离心1 min以浓缩菌液,100ul回溶菌体;
4) 将菌液涂于含有50 mg/l卡那霉素的固体LB培养基上,28℃,培养2-3 d ;
5) 通过菌落PCR筛选阳性克隆。
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