实验方法原理
| 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，细胞核较大而细胞质较少，核酸浓度高，且内含物少，次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS或CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。 提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活Dnase。 DNA定量分析可采用紫外光谱分析法。原理是DNA分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA的浓度成正比。此外，还可以通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带的亮度来分析，因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA Marker作为DNA相对分子质量及浓度的参考，样品DNA的荧光强度就可以大致表示 DNA量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA样品的完整性来进行，缺点是不太准确。 | |
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、实验材料和实验用品 植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根等）。 离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪及电泳槽。 CTAB提取液：2%CTAB（m/V）, 100mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20mmol/L EDTA pH8.0, 1.4mol/L NaCl, 2% PVP(灭菌后加入2% PVP, 使之充分溶解)。在研磨植物幼嫩组织前加入1%(V/V)β-巯基乙醇。 TE（pH8.0）:称取1.211 g Tris, 0.372 g EDTA-Na2, 先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。 氯仿/异戊醇（24:1, V/V）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）: 按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。 10 mg/L 的EB贮存液：在100 mL蒸馏水中加入 1g EB, 在磁力搅拌器上搅拌数小时，使其完全溶解，转至棕色瓶中避光4℃保存。EB是强诱变剂，称量时要戴手套和口罩。一旦接触了EB，立即用大量水冲洗。 1X TAE电泳缓冲液：50X TAE浓缩贮存液含Tris碱242 g，冰醋酸57.1 mL, pH8.0 的0.5 mol/L EDTA 100mL, 加600 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌，最后加蒸馏水定容至1000 mL。 6X凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(m/V)蔗糖水溶液，4℃保存。 3M NaAc（pH5.2） 二、实验内容和实验步骤 1．提取DNA （1）提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要在高压灭菌锅中121℃（约1.1 kg/cm2）高压灭菌20 min。 （2）用液氮将50mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5ml 离心管中加入预热至65℃的600μl 的CTAB提取液，轻摇混匀。 （3）65℃水浴1小时，其间轻摇混匀。 （4）12000rpm离心10min，取上清转移至另一1.5ml 离心管中。 （5）向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀10min，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管。 （6）向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10min，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管。 （7）向上清液中加1/10体积的3M NaAC (pH5.2)，等体积的冷异丙醇，小心混匀。12000rpm离心10min，弃上清。 （8）用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm离心，弃上清。 （10）将沉淀在超净工作台上吹干，加50μl TE (pH8.0)室温溶解。 电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。 2．浓度测定 （1）琼脂糖电泳法检测DNA 根据上样管的数量和电泳槽的大小估算琼脂糖胶的体积，称取琼脂糖干粉用1xTAE缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，配制时在电炉上加热使琼脂糖充分溶解，待温度降至60℃，加入EB, 使EB的终质量浓度为1 μg/mL，摇匀，倒入带有梳子的胶床中，避免产生气泡，室温下约30 min，胶自然凝固。 把琼脂糖胶放入电泳槽中，倒入1X TAE电泳缓冲液使液面高出胶面约0.5 cm。 移液器插上10μl吸头，吸入DNA样品和上样缓冲液的混合液后，尖端插入加样孔底部，缓慢把DNA样品加入到加样孔中。 加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，黑线接阴极。红线接阳极，打开电源，正确设定电压及时间，时间的选择取决于胶的长度和电压大小。一般不高于5 V/cm的电压，电泳约2 h，待溴酚蓝离胶边约1-1.5cm时停止电泳。 小心取出凝胶，置于紫外透射仪上，紫外灯下检测扩增片段的有无及分离情况，在凝胶成像仪上照相。 用λDNA做相对分子质量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker 20kb 的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA完整，没有降解。 （2）紫外分光光度法测定DNA的浓度 取少量待测的DNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100倍）。 用稀释液做空白，在260 nm、180 nm 、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 加入待测DNA样品在上述3个波长处读取OD值。 纯DNA样品的OD260/OD280值大约为1.8，高于1.8有可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染； 三、实验结果和计算  |
| 注意事项 | 轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切非常重要，不要振荡。 EB为强诱变剂，酚、氯仿、CTAB具腐蚀性或毒性，使用含有上述药品的溶液时，必须戴手套，盛有酚和氯仿的离心管要集中处理或丢弃。 |
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