植物DNA的提取与定量分析实验

实验方法原理 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，细胞核较大而细胞质较少，核酸浓度高，且内含物少，次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS或CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。

提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活Dnase。

DNA定量分析可采用紫外光谱分析法。原理是DNA分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA的浓度成正比。此外，还可以通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带的亮度来分析，因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA Marker作为DNA相对分子质量及浓度的参考，样品DNA的荧光强度就可以大致表示 DNA量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA样品的完整性来进行，缺点是不太准确。

实验材料 植物幼嫩组织

试剂、试剂盒 CTAB提取液

仪器、耗材 离心机离心管紫外分光光度计微量移液器吸头吸水纸水浴锅冰箱研钵液氮罐电子天平pH计高压灭菌锅一次性手套和口罩电泳仪及电泳槽

实验步骤

一、实验材料和实验用品

植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根等）。

离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪及电泳槽。

CTAB提取液：2%CTAB（m/V）, 100mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20mmol/L EDTA pH8.0, 1.4mol/L NaCl, 2% PVP(灭菌后加入2% PVP, 使之充分溶解)。在研磨植物幼嫩组织前加入1%(V/V)β-巯基乙醇。

TE（pH8.0）:称取1.211 g Tris, 0.372 g EDTA-Na2, 先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。

氯仿/异戊醇（24:1, V/V）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）: 按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

10 mg/L 的EB贮存液：在100 mL蒸馏水中加入 1g EB, 在磁力搅拌器上搅拌数小时，使其完全溶解，转至棕色瓶中避光4℃保存。EB是强诱变剂，称量时要戴手套和口罩。一旦接触了EB，立即用大量水冲洗。

1X TAE电泳缓冲液：50X TAE浓缩贮存液含Tris碱242 g，冰醋酸57.1 mL, pH8.0 的0.5 mol/L EDTA 100mL, 加600 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌，最后加蒸馏水定容至1000 mL。

6X凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(m/V)蔗糖水溶液，4℃保存。

3M NaAc（pH5.2）

二、实验内容和实验步骤

1．提取DNA

（1）提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要在高压灭菌锅中121℃（约1.1 kg/cm2）高压灭菌20 min。

（2）用液氮将50mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5ml 离心管中加入预热至65℃的600μl 的CTAB提取液，轻摇混匀。

（3）65℃水浴1小时，其间轻摇混匀。

（4）12000rpm离心10min，取上清转移至另一1.5ml 离心管中。

（5）向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀10min，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管。

（6）向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10min，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管。

（7）向上清液中加1/10体积的3M NaAC (pH5.2)，等体积的冷异丙醇，小心混匀。12000rpm离心10min，弃上清。

（8）用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm离心，弃上清。

（10）将沉淀在超净工作台上吹干，加50μl TE (pH8.0)室温溶解。

电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。

2．浓度测定

（1）琼脂糖电泳法检测DNA

根据上样管的数量和电泳槽的大小估算琼脂糖胶的体积，称取琼脂糖干粉用1xTAE缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，配制时在电炉上加热使琼脂糖充分溶解，待温度降至60℃，加入EB, 使EB的终质量浓度为1 μg/mL，摇匀，倒入带有梳子的胶床中，避免产生气泡，室温下约30 min，胶自然凝固。

把琼脂糖胶放入电泳槽中，倒入1X TAE电泳缓冲液使液面高出胶面约0.5 cm。

移液器插上10μl吸头，吸入DNA样品和上样缓冲液的混合液后，尖端插入加样孔底部，缓慢把DNA样品加入到加样孔中。

加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，黑线接阴极。红线接阳极，打开电源，正确设定电压及时间，时间的选择取决于胶的长度和电压大小。一般不高于5 V/cm的电压，电泳约2 h，待溴酚蓝离胶边约1-1.5cm时停止电泳。

小心取出凝胶，置于紫外透射仪上，紫外灯下检测扩增片段的有无及分离情况，在凝胶成像仪上照相。

用λDNA做相对分子质量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker 20kb 的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA完整，没有降解。

（2）紫外分光光度法测定DNA的浓度

取少量待测的DNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100倍）。

用稀释液做空白，在260 nm、180 nm 、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。

加入待测DNA样品在上述3个波长处读取OD值。

纯DNA样品的OD260/OD280值大约为1.8，高于1.8有可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染；

三、实验结果和计算

注意事项

轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切非常重要，不要振荡。

EB为强诱变剂，酚、氯仿、CTAB具腐蚀性或毒性，使用含有上述药品的溶液时，必须戴手套，盛有酚和氯仿的离心管要集中处理或丢弃。