毛细管区带电泳色谱仪分析技术

　一、工作原理：
　　CZE中，粒子的电荷性质不同，电泳方向不同；粒子的电荷数量不同，电泳速度不同；粒子的分子量不同，电泳速度不同。在毛细管中，由于电渗流的存在，所有粒子都随电渗流一起向负极迁移，电渗流速度约是一般离子电泳速度的5～7倍。各种电性粒子在毛细管中的迁移速度分别为：
　　1、阳离子：vap = veo+ vep，阳离子电泳方向与电渗流方向一致。
　　2、阴离子：vap = veo－vep，阴离子电泳方向与电渗流方向相反。
　　3、中性粒子：vap = veo，中性粒子运动方向与电渗流方向一致。
　　当样品从阳极端注入毛细管时，不同电性的粒子将按不同速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管，出峰顺序依次是阳离子、中性粒子和阴离子。中性粒子无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后流出，但不同结构的中性粒子无法相互分离（电泳图上是一个峰）。
　　电渗流在CZE中起着极其重要的作用：
　　1、电渗流具有象HPLC中泵一样的作用，推动粒子前进，加上不同粒子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性粒子的分离。
　　2、改变电渗流速度的大小和方向，可改变分离效率和选择性。这是CZE优化分离的重要因素。
　　3、电渗流速度的微小变化会影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积）。
　　二、特点：
　　1、毛细管不涂敷任何固定液。
　　2、结构简单，操作方便。
　　3、不能分离电中性组分，因为电中性组分的淌度差为零。
　　4、不能分离质荷比相近的组分，如蛋白质－SDS络合物。
　　三、定性和定量分析：
　　1、定性依据：不同组分的迁移时间不同。
　　2、定量依据：电泳峰面积或峰高。
　　四、操作条件：
　　CZE操作条件包括缓冲液、添加剂、分离电压和分离温度等选择。
　　1、缓冲液：
　　CZE分离过程在缓冲液中进行，缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和分离。
　　配制缓冲液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂。使用前要用0.45μm滤膜过滤以除去颗粒等。
　　（1）选择缓冲液应遵循的条件：
　　1）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。
　　2）在检测波长处无吸收或吸收值低。
　　3）为达到有效的进样和合适的电泳淌度，缓冲液pH值至少与被测组分的等电点相差l个pH单位。
　　4）自身淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。
　　5）只要条件允许，尽可能采用酸性缓冲液。在低pH值下，吸附和电渗流都很小，毛细管涂层的寿命较长。
　　6）与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。
　　（2）缓冲液pH值的选择：
　　1）缓冲液pH值的选择与样品性质有关。
　　①通常酸性组分选择在碱性条件下分离。
　　②通常碱性组分选择在酸性条件下分离。
　　③蛋白质、多肽和氨基酸等两性物质可选酸性（pH = 2）或碱性（pH＞9）分离介质。
　　④糖类样品通常在pH = 9～11能获得zui优分离。
　　⑤羧酸或其它样品多在pH = 5～9选择分离条件。
　　2）缓冲液pH值的选择和毛细管种类有关。
　　很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用，如聚丙烯酰胺涂层毛细管只能在pH = 4～9使用，否则涂层易水解失效。
　　3）在相同pH下，不同缓冲液的分离效果可能相差很大。
　　一般来说，能与样品发生相互作用的试剂可能是的。如分离糖类和DNA等分子时应优先使用硼酸盐缓冲液，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲液也适用于分离其它含邻羟基和多羟基的化合物。
　　4）为了选择合适的pH值，需要用pH调节剂调整介质的酸碱性。
　　由于多数缓冲试剂是酸性物质如磷酸，所以pH调节剂主要是碱类。常用pH调节剂有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有机碱如乙醇胺和乙二胺。如果缓冲试剂为碱类，可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸如H3PO4。
　　缓冲试剂和调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附和控制焦耳热等都有影响。一般缓冲试剂的浓度在10～200mmol/L，有时为了抑制蛋白质等的吸附作用，浓度可高达500mmol/L（此时应减少分离电压）。电导率大的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等的浓度一般在20mmol/L，电导率小的缓冲试剂如硼酸的浓度可在100mmol/L以上。
　　2、添加剂：
　　如果缓冲液经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果，可加入添加剂以改善分离。常用添加剂有：
　　（1）无机电解质：NaCl和KCl等。
　　（2）有机溶剂：甲醇和乙腈等。
　　（3）非电解质高分子：纤维素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。
　　（4）功能性添加剂：手性冠醚和环糊精等。
　　3、分离电压：
　　分离电压是控制柱效、分离度和迁移时间的重要因素。分离电压与毛细管内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关，电压的极值范围因系统和组成而异。
　　当柱长一定时，在一定电压范围内，电压与粒子的迁移速度成线性关系。
　　当电压过高时，线性关系偏移，主要是由高电压引起的焦耳热造成的。电压升高，产生的焦耳热增多，在不能有效驱散所产生焦耳热的情况下，柱温会显着升高，工作电流增大，柱效和分离度降低。除了采取有效的散热措施外，选择合适的条件，使在此条件下允许使用较高电压，而不致产生过大的电流和过多的焦耳热，是非常重要的。一般通过作I－V曲线来选择体系的zui优分离电压。
　　4、分离温度：
　　毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。
　　温度应通过实验确定。多数情况下，在20～30℃进行电泳能获得良好的分离效果。一些糖类样品需要高于室温的分离条件，一些样品如蛋白质等可能需要低于室温的分离条件。
　　五、应用：
　　CZE是CEzui基本、应用zui广的分离模式。
　　可分离蛋白质、多肽和带电荷的大小分子。