氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定实验

氯霉素乙酰转移酶报告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能将乙酰基从乙酰辅酶A转移到氯霉素上。本试剂盒采用荧光测定的方法，检测CAT活性，它的灵敏度接近同位素测定方法，而操作极为简便、快捷，成本也大为降低。使用通用裂解缓冲液，能与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。

细胞样本

Tris-缓冲液 Tris 三硝基甲苯（Triton） CAT 稀释缓冲液 CAT 酶标准物 闪烁液 聚丙烯闪烁杯

微量离心管 微量离心机

一、材料

灭菌物品

1. D-PBSA

2. 多孔培养板：6 孔，35 mm

非消毒物品

1. Tris-缓冲液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0

2. Tris/三硝基甲苯（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 储存

3. CAT 稀释缓冲液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA

4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 100% 甲醇；分装，-70℃ 储存

^{5. 14}C-CoA：¹⁴C-丁酸辅酶 A（10uCi/mL；AmershamPharmacia）

6. CAT 酶标准物：制备含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 标准液的 CAT 稀释缓冲液，4℃ 储存

7.「鸡尾酒」闪烁液：Econofluor（Invitrogen）

8. 去离子蒸馏水（DDW）

9. 聚丙烯闪烁杯：3.5 mL

10. 微量离心管

11. 微量离心机

12. 冰浴

方法A：6 孔、35 mm 培养板上的细胞收集

1. 转染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗涤细胞。

2. 将培养板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。

3. 将培养板-70℃ 冷冻 2 h。

4. 于 37℃ 下解冻培养板，然后将其置于冰上。

5. 将细胞裂解物移至微量离心管中，以最大速度离心 5 min。

6. 收集上清液，65℃ 加热 10 min，以灭活 CAT 抑制物质。

7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液（细胞裂解物），将上清液保存在-70℃。

方法 B：CAT 测定

8. 从每一样品中取 5~150uL 细胞裂解物，移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中，并且加入足够的 0.1mol/L Tris，终末体积为 150uL。

9. 设空白杯，加入 150uL 0.1mol/LTris 液，作为阴性对照。

10. 阳性对照：
（a）取 5 个闪烁杯，各加入 150uL 0.1mol/LTris。
（b）将 5uL 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中，绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。

11. 在所有样品杯（包括对照）中，加入 100uL 以下混合液：
（a）84uL 超纯水
（b）10uL 0.1mol/LTris
（c）1uL 的氯霉素
（d）5uL（50nCi）的 ¹⁴C-CoA

12. 拧紧杯盖，于 37℃ 下孵育 2 h。

13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor，拧紧杯盖。

14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分。

15. 室温下孵育 2 h。

16. 在一个液闪计数仪上测定 30s 闪烁次数。                                                                  

1. 在表达质粒扩增与制备一步，要特别注意其纯度（不能含RNA和染色体DNA）以免影响转化效率

2. 制备方法最好选用溶菌酶加Triton10，然后氯化艳梯度离心。

3. 一定要有对照组用CAT酶代替细胞提取液，来验证反应及层析等过程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表达质粒验证转化及重组两步的正确性。

4. 在制备细胞提取液中最好选用超声波破碎法，离心前要注意检查破碎程度。冻融法繁琐有时破碎不彻底影响结果。

5. 4mmol/L乙酞辅酶A可每次取1.smg溶在500川水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20℃，但不可超过十天。

成功地组装表达质粒是该项检测技术的关键之一,表达DNA质粒必须具有下列几种元件:（1）供细胞复制的原核编码顺序和供啼选用的标记基因(抗菌素基因);（2）控制真核细胞转录的调控元件(增强子、启动子);（3）控制转录后的一些信号,转录加工裁剪信号,加尾信号,供在哺乳动物表达中用;（4）未知待测基因顺序可取代上述的转录调控顺序;（5）标记基因(氯霉素乙酸转移酶)。

参考：
1、《动物细胞培养：基础技术指南（第五版）》；
2、《霉素乙酞转移酶检测(CATassay)基础医学与临床》