水扬酸比色法测定蛋白质

　　1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。

　　2 方法 （１）标准曲线的绘制

　　取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6

　　分别加空白酸液 2ml

　　分别加磷酸盐缓冲液 5ml

　　稀释至总体体积至15ml

　　分别加水扬酸钠 5ml

　　37C水浴 15分钟

　　加入次氯酸钠 2.5ml

　　37C水浴 15分钟

　　取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。

　　（2）样品处理：

　　准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大

　　火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量

　　瓶。

　　（3）样品测定：

　　准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加

　　5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同

　　并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。

　　（4）计算

　　 C×F

　　含氮%=    ---× 100

　　 W×1000×1000

　　C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）

　　F---样品溶液的稀释倍数

　　W---样品重量（g）

　　pro%=总氮%×K（K可为6.25，也可查）

　　3注意事项：

　　A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。

　　B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。

　　C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。

　　4 试剂

　　（1）氯标液：称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于

　　1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。

　　（2）空白酸液：称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→

　　使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。

　　（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水

　　溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加

　　入水稀释至1000ml备用。

　　（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释

　　至500ml

　　（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml

　　 5 仪器

　　（1）分光光度计

　　（2）恒温水浴