汪阳明组“miRNA与sgRNA联姻”打造基因编辑体系控制新平台

　　miRNA是一类长度约22个碱基的核糖核酸分子，广泛表达于植物，动物以及病毒中。miRNA通过与Argonaute (AGO)等蛋白形成RNA诱导沉默复合物（RNA Induced Silencing Complex，RISC），在转录后水平抑制基因表达【1，2】。其表达谱呈现细胞特异性【3】，即特定细胞一般会大量表达某一个或几个miRNA，例如，心脏细胞中的miR-1，肝脏细胞中的miR-122；不同的癌症组织甚至相同癌症的不同阶段也会特异表达不同的miRNA。因此，特定miRNA或者几种miRNA组合的表达可以用作指征细胞发育和疾病状态的标志物。理论上，这种高度特异性信息可以被应用于控制报告基因或者内源基因的特异性表达，以此实现标记或者操控特定细胞。然而，由于miRNA具有抑制基因表达的天然属性（特殊情况除外），迄今尚未有直接、灵敏且正向反应miRNA活性的生物传感器。

　　而来自于微生物的II型规律成簇短回文重复序列系统（Type II CRISPR）自从2012年被改造为基因编辑工具后【4】，带来了生物学研究、疾病治疗以及农作物育种等方面的一系列革命性进展，并有望在未来持续改变世界。但是，如何精确地实现CRISPR只在特定类型细胞中执行工作仍是该技术面临的一大难题。

　　有意思的是，当研究人员将miRNA传感器和精准控制CRISPR体系结合在一起考虑的时候，上述两个问题都迎刃而解。

　　北京大学分子医学研究所汪阳明研究组长期从事非编码RNA在干细胞的自我更新与分化过程中的功能及其作用机理，最近该课题组发明了一种由微小核糖核酸(miRNA)控制CRISPR开启的技术平台，开发出了在活细胞中监测miRNA活性的传感器，成功实现了CRISPR基因编辑体系的细胞特异调控。该项成果以A microRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform serves as microRNA sensors and cell type specific genome regulation tools为题于2019年2月25日在线发表于Nature Cell Biology杂志。

　　CRISPR基因编辑体系分为两个部分：一个由蛋白质（Cas9或者Cas9突变体融合蛋白）组成，执行基因编辑或控制基因表达的任务；另一个是sgRNA，介导Cas9蛋白质在基因组特定位置的结合【4】。研究人员通过设计具有miRNA结合位点的没有活性的sgRNA前体，使得只有在特定miRNA表达的细胞中，才会通过miRNA介导的切割反应产生成熟的sgRNA,继而引导CRISPR基因编辑体系启动工作（图1）。

图1：MICR，miRNA诱导启动的CRISPR基因编辑平台

　　该研究中发明的miRNA诱导启动的CRISPR基因编辑平台（MICR，miRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform），简单地说，就是给基因编辑平台安上了一个开关，这个开关只有特定miRNA才能打开，因此只在表达特定miRNA的细胞或组织中开启基因编辑，而不影响其他组织和细胞。由于miRNA和siRNA切割RNA的机理相同，因此MICR也可以用作感知外源或内源siRNA的传感器。MICR的发明实现了对CRISPR基因编辑系统的精准控制，有望增强相关基因编辑技术在疾病治疗过程中的安全性和有效性。

　　在该研究中，通过将MICR与荧光蛋白表达相偶联，研究人员首先成功实现了活细胞水平miRNA活性的可视化监测，荧光蛋白的表达水平与细胞中的miRNA的拷贝数在大约10-5000的范围内（更高拷贝数的情形尚未测定）呈现正相关。接着，研究人员构造了miR-294和miR-1控制的荧光蛋白报告平台，分别用来监测了胚胎干细胞和肌肉前体细胞的分化状态，结果显示细胞的分化状态与miRNA活性水平呈现很好的相关性。当将sgRNA前体设计成靶向内源基因时，他们还成功实现了细胞特异性地激活或者抑制内源基因表达。另外，当将Cas9效应蛋白换成碱基编辑器(Base Editor)时，MICR可以在miRNA的诱导下精准编辑染色质上的精确位点。最后，利用MICR报告基因平台监测胚胎干细胞中不同miRNA的表达活性，研究人员首次在胚胎干细胞中发现了miR-21活性呈现不均一调控的异质性现象，且该异质性与干细胞发育和分化相关基因的表达水平显著关联，这一发现为miRNA的研究拓展了潜在的新方向。这些研究表明MICR可以被用来实现活细胞中的miRNA活性监测以及细胞特异性地控制CRISPR基因编辑体系，包括激活、抑制以及碱基编辑等。

　　在MICR的设计中，由于sgRNA的数目不受限制，因此该平台可以感知多个miRNA并对不同基因位点进行精准调控。作为这一概念的佐证，研究人员进行了简单的“或门”计算，并成功实现了在同一细胞中感知两种miRNA分别开启绿色或红色荧光蛋白表达(图2）。理论上，如果设计sgRNA感应N种不同的miRNA并控制不同的基因表达，则可以达到2N种不同的输出结果。对于多个miRNA的感知可以进一步增强MICR体系的细胞特异性。

图2：利用MICR感知两种不同的miRNA控制荧光蛋白表达

　　MICR平台有望广泛应用于动植物及病毒相关系统的研究，并且MICR平台具有兼容性，可以和其他控制CRISPR的技术，如小分子和光遗传学相关技术联合使用，为合成生物学、基于基因编辑体系的基因治疗提供新的技术手段和思路。值得一提的是，相关发明目前已申请ZL两项。

　　据悉，北京大学分子医学研究所汪阳明博士为该研究的通讯作者，2013级博士生王茜雯和胡鲁峰为该论文共同第一作者，郝菁、廖乐祺、邱雅姿和石铭参与工作。

　　参考文献

　　1，Hutvagner, G. & Zamore, P.D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297, 2056-2060 (2002).

　　2，Zeng, Y., Yi, R. & Cullen, B.R. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 9779-9784 (2003).

　　3，Landgraf, P. et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell 129, 1401-1414 (2007).

　　4，Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).