活体成像中荧光色素标记细胞的方法

实验概要

本实验以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介了一两种内源性荧光色素标记的实验方法。

实验原理

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP，Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。
该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。

实验步骤

1. 用荧光色素DiD标记间充质干细胞
   1) 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液；
   2) 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记；
   3) 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS，钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心；
   4) 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml，确保瓶的表面被完全覆盖；
   5) 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟；
   6) 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功；
   7) 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶；
   8) 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
   9) 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；
   10) 400 RCF离心5 分钟；
   11) 小心移去上清液，不要扰动细胞；
   12) 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数；
   13) 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x10⁶/ml ；
   14) 每ml细胞悬浮液加入5 µL DiD 染色液；
   15) 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀；
   16) 在6孔低附着性细胞板上37°C 孵育20分钟；
   17) 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；
   18) 400 RCF离心5 分钟；
   19) 小心移去染色液，不要扰动细胞；
   20) 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
   21) 重复洗三次；
   22) 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；
   23) 进行活细胞成像。

2. 用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞
   1) 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合；
   2) 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 µL DMSO中溶解ICG；
   3) 向混合物中加入 400 µL Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM加10% 胎牛血清)，震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml；
   4) 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞；
   5) 在300 µL ICG 和 300 µL 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 µL 硫酸鱼精蛋白溶液，使之终浓度为 10mg/ml，；
   6) 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕；
   7) 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基；
   8) 加入5ml预热的 DMEM；
   9) 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37°C下孵育1h；
   10) 孵育完全后移去染色液；
   11) 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液；
   12) 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37°C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好；
   13) 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
   14) 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶；
   15) 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟；
   16) 在全培养基中悬浮细胞；
   17) 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心；
   18) 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离；
   19) 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中；
   20) 37°C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮；
   21) 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液；
   22) 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；
   23) 进行活细胞成像。