活体法检测物体内硝酸还原酶活性实验

实验步骤：

一、材料仪器设备及试剂

1. 材料：水稻或小麦的叶片、幼穗等。

2. 仪器设备：真空抽气泵；真空干燥器；小烧杯；玻璃瓶塞；其它用具同离体法。

3. 试剂及配制：

亚硝酸钠标准液（与离体法相同）。

0.1mol·L－1KNO3（配制方法同离体法）。

1％磺胺（配制方法同离体法）；

0.02％萘基乙烯胺（配制方法同离体法）。

30％三氯乙酸溶液配制：称取30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml。

二、实验步骤

1. 标准曲线制作 ( 同离体法)。

2. 酶促反应

（1）称取作物叶片1.0～2.0g四份，剪成1cm左右的小段，分放于四个小烧杯中，用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底，其中一份作对照，另外三份作酶活性测定用。

（2） 先向对照杯中加入1ml 30％三氯乙酸，然后各杯中都加入9ml 0.1 mol·L－1KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气1min再通入空气，再抽真空，反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全软化沉入杯底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，在25℃黑暗中反应半小时，再分别向测定杯（对照杯除外）加入1ml 30％三氯乙酸终止酶反应。

3. 测定

将各杯摇匀静置2分钟后，各取2ml反应液到试管中，加入1ml 1﹪磺胺和1ml 0.02﹪萘基乙烯胺，摇匀显色15min后，再倒入离心管中，在4000 r / min下离心15min，取上清液在520nm波长处测定吸光度（A）值。并从标准曲线查出反应液中的亚硝态氮含量（μg）。

三、酶活性计算 （ 同离体法）。

注意事项：

1. 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。

2. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位应一致。

3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。

4. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。