活体电穿孔法介绍2

电　压

电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。电压过低或过高都会影响外源基因的表达。电压过低时，无法造成细胞膜表面状态的改变，因而外源D 不能进入细胞内。电压过高时，局部组织积聚过多热量，造成细胞的死亡或组织失去功能，即使外源基因导入细胞，也无法进行正常的表达。哺乳动物常用的活体电压大多为20～100VPcm ，最高电压在250～750VPcm。

电穿孔次数和时间

有试验证明，皮肤的电阻在每一次电穿孔后都有所降低，说明电穿孔使皮下组织形成孔道，且其大小随电穿孔而变大，经过电穿孔的处理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊内表达。但电穿孔次数不能过多，否则会对局部的细胞组织造成不可逆的损害，基本应在10 次以内，

每组电穿孔时间应在20～100msec 。

能量的测算

电穿孔过程中能量的测算公式为: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表电穿孔时导入的能量，V 代表施加的电压，T 代表电穿孔延续的时间，R 代表作用组织的电阻。试验证明在导入能量一定的情况下外源基因转移效率也相近。在此原则基础上可根据不同的组织器官选择不同的电压和电穿孔时间。

温　度

由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热，因此操作过程中，DNA 转染试剂应保持4 ℃，同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低，Muramatsu 证明温度较低的情况下，外源基因的转移表达效率会有明显的提高。此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA 的流失，这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。

DNA 的状态和浓度

很多试验都证明线状DNA 较环状DNA 在活体电穿孔法瞬时表达系统的建立中效果较好[12 ] 。DNA 的浓度应在1～40mgPml 范围内。

DNA 溶液组分

DNA溶液中不应含有不能分解成离子的组分，如甘露糖醇、蔗糖等。这些大分子存在时会降低基因的转移效率。

5、活体电穿孔法在不同组织上的应用

肌肉组织

在肌肉组织中最初进行外源基因活体导入是采用电穿孔法。选择肌肉组织作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大，约占40 % ，而且外源基因可在肌肉中长期表达、分泌，在基因治疗中经常会用到。此外，外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。

皮　肤

皮肤组织相对于其他组织较难进行电穿孔法的基因导入，因为皮肤比较薄，电阻相对低，要求电流较高。但如果电流过大，会严重影响基因的表达，因此应适当降低电流和电压，延长电穿孔的时间。另外，由于皮肤组织含有的脂肪细胞分布不均，会干扰电穿孔的作用，因此只推荐用镊状电极，且应将动物被毛刮净后操作。虽然外源基因在皮肤中表达的时间较肌肉中短，但可利用活体电穿孔法对很多皮肤疾病进行治疗。