活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

抗体血清

RPMI1640DPBS洗涤液固定液

玻璃管塑料管离心机显微镜

1.  制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）

2.  用10 ％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷ /ml

　　　　　　　　
3.  取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4 ℃ 30 min

　　　　　　　　
4.  用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右，1000 rpm×5 min

　　　　　　　　　
5.  弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇，4 ℃ 30 min

　　　　　　　　　
6.  用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min

7.  加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1 ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500 μl固定液）

8.  FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）

1.  整个操作在4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN₃，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　
2.  洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　
3.  加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　
4.  细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

一、附录

　　
1.  DPBS （×10， 贮存液）
 

NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸馏水加至1000 ml，Na₂HPO₄ 11.5 g，临用时用蒸馏水1∶10稀释，KH₂PO₄ 2 g

　　
2.  洗涤液
 

DPBS 900 ml，FCS 50 ml（终浓度5 ％），4 ％ NaN₃ 50 ml（终浓度0.2 ％）

　　
3.  固定液
 

DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（终浓度2 ％），甲醛 10 ml，NaN₃ 0.2 g （终浓度0.02 ％）