流式细胞仪免疫分析的技术有哪些要求呢

　　一、免疫检测样品制备

　　（一）新鲜实体组织单细胞悬液的制备：最常用的方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法等方法。

　　（二）单细胞悬液的保存：最常用的处理方法有三种：深低温保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。

　　二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

　　在流式细胞免疫分析技术中，被测定的信号参数主要包括散射光信号和荧光信号两种，荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后，在激光束激发下产生的发射光。因此，荧光染料的选择和标记染色都是保证荧光信号产生非常关键的技术指标。

　　（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料

　　用于免疫荧光染色的染料需具备以下几个条件：

　　荧光染料应有较高的量子产额和消光系数；

　　荧光染料对488nm的激发光波长有较强的吸收；

　　发射光波长与激发光波长之间应有较大的波长差；

　　容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。

　　1.异硫氰酸荧光素（FITC）：可产生亮绿色荧光。FITC是免疫荧光标记最常用的荧光探针。

　　2.德州红：与生物素偶联的抗体有很强的亲和力，产生红色荧光。

　　3.藻胆蛋白类：主要包括藻红蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、别藻青蛋白（APC）三类。多发生橙色至红色荧光。

　　4.能量传递复合染料

　　（二）免疫荧光标记

　　1.直接免疫荧光染色：特异性强，荧光标记干扰因素少

　　2.间接免疫荧光染色

　　3.双参数或多参数分析时荧光抗体的组合标记

　　（三）细胞自发荧光

　　三、免疫胶乳颗粒技术的应用

　　“液相芯片”技术是胶乳颗粒在流式细胞分析中的应用，流式微球阵列（CBA）技术属于其中的重要代表。

　　四、流式细胞免疫学技术的质量控制

　　（一）单细胞悬液制备的质量控制

　　1.采用适当的制备方式。

　　2.用溶血剂处理红细胞。

　　3.实体组织来源标本在制备单细胞悬液过程中，最好采用机械法。

　　4.温度与pH。

　　（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制

　　1.温度对荧光染色的影响。

　　2.pH对荧光发射强度的影响。

　　3.荧光染料浓度的控制。

　　固定剂对免疫荧光染色的影响。