流式细胞仪的分析及分选原理

流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和数字信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带细胞分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。

一、工作原理

流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术，将荧光显微镜的激发光源改为激光，使其具有了更好的单色性与激发效率，同时利用荧光染料与单克隆抗体技术的发展，提高了检测的灵敏度和特异性，并将固定的标 本台改为流动的单细胞悬液，用计算机进行光信号的数据处理分析，提高了检测速度与统计分析的精确性能。能同时从一个细胞上获取多种参数资料。

(一)基本组成结构

1．液流系统

由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。细胞悬液进入鞘液中的孔径通常 为 50～300μm孔径。

2．光学系统

由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。

(1)激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氩离子激光器；

(2)分色反光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。

(3)光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成，作用是将激 光器发射的激光束聚焦成高 15μm，宽 57 μm的椭圆光斑。

(4)透镜组：有三个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。

(5)滤片：长通滤片一允许长于设定波长的光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光通过；带通滤片一允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过，有 525 nmBP，575 nmBP，620 nmBP，675 nmBP 4 个。

(6)光电倍增管(pholomultiplier tube，PMT)：由 FS，SS，FLl，FL2， FL3，FIA 组成，主要作用是检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲(数字数据)信号。当调整 PMT 电压，脉冲信号也发生改变。

3．数据处理系统

主要由计算机及其软件组成。能对实验分析数据的存储、显示和分析更加智能化和自动化，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。

(二)基本工作原理

按检测需要标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，该液柱以稳定的层流形式通过喷嘴高速射下，液柱与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换，储存，分析，处理，按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上，包括了单参数和二维或三维图像资料，阳性细胞百分率，x±s，斜率，峰值，峰面积等多参数资料。一台好的流式细胞仪每秒可测量 15 000 个细胞，测定 1 000 个荧光染料分子的粒子，这是目前其他仪器尚无法做到的。