流式细胞仪定量分析细胞凋亡

流式细胞仪检测具有以下特点：
1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2）、可以做许多相关性分析
3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种：
1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。