实验概要
为了便于对疟原虫侵袭红细胞表型的分析，我们开发出基于两色流式细胞仪区分寄生虫入侵和寄生虫生长的新平台。使用酶处理后，用染料CFDASE或DDAO SE标记靶细胞的一个或多个受体。培养恶性疟原虫的寄生虫，对寄生虫入侵细胞与荧光DNA插层染料 Hoechst 33342或SYBR Green标记并进行检测。标记红细胞的干扰入侵，细胞和寄生虫染料的组合概括为三个标准的入侵表型。以最小的重叠组合验证了三种不同的染料，这意味着同样的实验，可以适应不同仪器的几种激光线的组合。该法是敏感的，在96孔板中，可以用来定量自然红细胞入侵效率或实验的遗传变异的影响。
实验步骤
标记目标红细胞：
根据选择的DNA染料选择对目标红细胞的荧光标记，这本身就取决于流式细胞仪在入侵检测分析结束时获得的数据，CFDA SE的荧光发射峰约为517nm，接近520nm处SYBR Green I的荧光。CFDASE可以与Hoechst 33342组合使用，DDAO SE 的荧光发射峰接近657nm。因此，它可以与Hoechst 33342或SYBR Green I组合使用。
1．加入12mL RPMI 1640和0.5mL水洗红细胞到50mL管中轻轻混匀，获得2％比容的血细胞和。
2．将3mL 2％比容红细胞悬浮液转移到15mL标有“染色红细胞 ”的管中，离心3分钟。
3．吸取并弃掉离心管的上清液。
4．加入3.1mL 的RPMI 1640到15mL标有“CFDA的”管（或“DDAO”）。
5．加入12.4μL含5mM CFDA SE的二甲基亚砜（或6.2μL5mM DDAO SE的二甲基亚砜）至“CFDA” 管（或“DDAO”）获得20μM混悬溶液（或10μM），然后混合。
6．加入3 mL 20μMCFDA SE（或10μM DDAO SE）至“染色红细胞 ”管，并立即上下吹吸使得溶液混合。
7．将试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育2h。
8．离心“染色红细胞”管3分钟。
9．吸取并弃掉所有上清液。
10．加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。
11．离心3分钟。
12．吸取并弃掉所有上清液。
13．加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。
14．将试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育2h。
15．离心3分钟。
16．吸取并弃掉所有上清液。
17．加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。
18．离心3分钟。
19．重复步骤16至18一次。
20．吸取并弃掉所有上清液。
21．加入3 mL不完全培养基，并吸取和悬浮细胞沉淀。
酶法处理：
1．从“染色红细胞”试管中吸取400μL细胞悬液转移到标记“A”到“F”的离心管中。
2．加入含1U/mL神经氨酸苷酶的RPMI 1640 溶液8μL管B和管E 。
3．将6个试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育1h。
4．用台式微量离心机离心试管。
5．吸出并丢弃上清。
6．加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。
7．吸出并丢弃所有管中的上清。
8．加入400μL不完全培养基至6个试管中悬浮沉淀。
9．加入2μL 10mg/ml蛋白酶0至C试管，加入40μL 10mg/ml蛋白酶至D、E试管，40μL 10mg/ml的糜蛋白酶至管F。
10．将6个试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育1h。
11．将6个试管用台式微量离心机离心30s。
12．吸出并丢弃上清液。
13．加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。
14．重复步骤12和13一次。
15．吸出并丢弃上清液。
16．加入400μL不完全培养基，吹打细胞，悬浮颗粒。
标记培养板和培养：
1．在96孔板盖子的顶部标记18个孔从A至E和1至3 。
2．加入大约200μL PBS至78个未标记的孔中。
3．加入50μL donor pRBC至2％比容，1-2％的原虫血症至18孔标记的细胞板，并标记为A1至F3。
4．旋转板180度。
5．加入50μL 目标红细胞至2％比容至相应的孔。（如从离心管中吸取50μL到每个孔A1，A2和A3）6．小心翼翼地取向上和向下吹吸18孔的混合溶液，避免气泡。
6．将培养板放入培养箱，37°C预热。
7．取出培养板，加入1％O2，3％二氧化碳平衡氮气3分钟。
8．将板放入培养箱，在37°C孵育48小时。
寄生虫染色：
如果目标红细胞用CFDA SE进行染色，寄生虫染色必须用Hoechst 33342。如果目标红细胞染色用DDAO SE，根据流式细胞仪上的激光线，染色寄生虫可用Hoechst 33342或SYBR Green 1 。
下面是SYBR Green I染色的过程：
1．离心3分钟。
2．吸取并弃掉18孔50μL 培养上清液并标记为A1至F3。
3．在18孔中加入200μL的PBS并离心3分钟。
4．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
5．加入200μL含 2％paraformaldehyde/0.2％戊二醛的PBS，重悬浮细胞沉淀，在4℃的孵育1h 。6．离心3分。重悬浮细胞沉淀。
6．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
7．18孔每孔加入200μL的PBS并离心3分钟。
8．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
9．18孔，每孔加入200μL含0.3％Triton X-100 的PBS，重悬浮细胞沉淀，室温孵育10分钟。11．离心3分钟。
10．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
11．18孔每孔加入200μL的PBS并离心3分钟。
12．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
13．18孔，每孔加入200μL含0.5mg/ml核糖核酸的PBS，重悬浮细胞沉淀，37°C孵育1h。16℃离心3分钟。
14．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
15．加入200μL的PBS离心3分钟。
16．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
17．18孔，每孔加入200μL 1：5,000的 SYBR Green I，重悬浮细胞沉淀，37°C孵育1小时。
18. 离心3分钟。
19．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
20．加入200μL的PBS离心3分钟。
21．重复步骤22和23两次以上。
22．吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。
23．18孔，每孔加入200μL PBS，重悬浮细胞颗粒。
流式细胞仪测试：
1． 96孔板在平底板上的盖子上标记18孔，从A1到F3。
2．18孔，每孔加入250μL PBS。
3．从18孔中吸取25μL染色细胞进行入侵检测，再把它加入新的培养板中只包含PBS。
4．吹吸混合，稀释细胞悬液。
5．采集能在流式细胞仪上产生适当激光线的稀释的细胞悬液，进行荧光标记和DNA染料选择（获得10万事件最低得到50000靶细胞进行分析）。
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