流式细胞仪检测实验_TUNEL组织切面中的凋亡细胞原位杂交

要分析的新鲜组织

含1% （m V)多聚甲醛的PBS (低温揽拌溶解过夜用之前过滤)Tris缓冲盐（TBS)含 0.1% (V V) H2O2 的 TBSTdT反应液TdT 地高辛（digo×igenin下同）-dUTP混合液2% (V V)马血清或含FBS的TBS羊抗地高辛初级抗体溶液HRP共轭的抗羊二级抗体溶液AEC底物工作液Mayer 苏木精

Crystal Mount 封固介质疏水的棚栏载玻片标志（如 PAP Pen)Coplin广口瓶或染色托盘加湿箱

1) 准备5〜8μm的冰冻切片，室温过夜晾干载玻片。石蜡切片也可以用；切片应该事先制备，水化，然后真空干燥。

2) 用PAP笔在每个切片周围的玻璃上划一条疏水界线。

3) 用1%多聚甲醛完全覆盖整个切片，在一个密闭的箱内室温孵育30 min。

4) 倒掉多聚甲醛，洗涤载玻片在含TBS的广口瓶或含染色托盘内室温孵育5 min，在孵育过程中，载玻片从该溶液浸入、取出3〜4次。

5) 用含0.1%(V/V) H₂O₂的TBS覆盖切片。置一个密闭箱室温孵育30 min,以猝灭内源的过氧化物酶活性。

6) 按照步骤4用TBS洗涤，用TdT反应液覆盖切片，以冲洗掉TBS。

7) 尽可能地去除反应液，加入25μL的TdT/地高辛-dUTP混合液。在加湿箱内37℃ 解育45〜60 min。

8) 用TBS洗涤载玻片一次，然后用2%马血清或含FBS的TBS洗一次，洗涤过程参照步骤4。

9) 用羊抗地高辛初级抗体溶液覆盖切面，在一个密闭箱内室温孵育1 h。

10) 按步骤8洗涤载玻片，然后用HRP共扼的抗羊二级抗体溶液覆盖切片，密闭箱内室温孵育1 h。

11) 按步骤8洗涤载玻片，然后用AEC底物工作液覆盖切片，室温孵育10〜20 min。

12) 按步骤8洗涤载玻片，在Mayer苏木精里孵育0.5〜1 min复染。然后用自来水在 Coplin广口瓶内洗漆5 min。

13) 擦去切片周围多余的水，用Crystal Mount封固盖玻片。