流式细胞仪检测技术

实验方法原理

流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。

实验材料 淋巴细胞外周血的白细胞

试剂、试剂盒 FACS缓冲液PBS叠氮钠溶液仪器缓冲液FACS清洁液FACS洗净液

仪器、耗材 流式细胞仪

实验步骤

一、 细胞和试剂的准备

1.  细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。

2.  荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。

3.  封闭抗体：抗Fc受体抗体

4.  FACS缓冲液：

1×PBS  950 ml

FCS  40 ml

10%叠氮钠溶液  10 ml

5.  仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供

6.  FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。

二、操作步骤

1.  单细胞悬液的制备：将1×105~1×107的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。

2.  封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分钟。

3.  细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分钟。

4.  洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl，轻轻混匀，3000 r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。

5.  上样前处理：取100 μl 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。

三、仪器的操作

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的准备

（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。

（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。

（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。

（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。

2.使用中的操作

（1） 计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件：

①设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。

②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。

③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。

④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。

⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。

⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表

CD69分子表达检测直方图的数值说明

b.abti-CD3（2 ng/ml）检测结果

c.abti-CD3（10 ng/ml）检测结果

CD4及CD8细胞点状二维图结果

不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表

（2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。

先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。

3.使用后的清洗  所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。

（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。

（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。

（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。

（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。

（5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。

（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。

注意事项

1.  减少非特异荧光染色

（1）细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

（2）封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

2.  单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

3.  如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。