流式细胞仪检测细胞凋亡实验protocol

　　40年来，流式细胞术一直由多色流式主导。 尽管Fulwyler发明的初代仪器基于库尔特体积，但荧光在短短几年内成为流式细胞仪主导技术。 从20世纪80年代初到现在，技术开发人员一直致力于构建能够测量更多荧光参数（我们通常将其称为“颜色”）的仪器。

　　最开始，Göhde在1968年首次发表关于荧光流式细胞仪的论文，紧随其后的是来自洛斯阿拉莫斯的van Dilla的报道，两者都测量了一个荧光信号。 在之后的10年内，Mike Loken将可测量参数扩大到了两个，并证明双参数具有更大的优势，于是，流式细胞仪领域从单参数开始进入多参数时代。 最早的三色流式细胞仪出现在20世纪80年代初期，之后在几年内三色流式细胞仪就开始流行，到了20世纪90年代中期，三荧光参数流式细胞仪已是司空见惯了，并自然而然地出现了四色流式，随之，立即出现了补偿问题。自此之后，补偿就成了流式细胞仪每个检测都需要解决的问题，也成了每场研讨会都需要重复的经典话题。 然而，补偿仍无法简单地解决，还是需要大量的经验和精力去对付。

　　在20世纪90年代，增加流式细胞仪的参数数量，很明显是为了发现生物学更深层次的机制。流式细胞术应用的最终目标就是在单细胞水平上发现细胞受体和功能之间直接和决定性关系，虽然我们已经具有前向和侧向散射光参数，这两个参数跟荧光也有关联性，但是添加更多荧光参数能提供直接相关的关系，这些关系无法通过诸如光散射之类的信号识别的。

　　Mario Roederer和他的团队是引领多色流式的先锋，在1997年之前开始用8色流式，到2001年用11色，到2004年用17色。2004年至今，参数数量稳定增加到27～30色。

　　回顾过去，流式细胞仪从1参数发展到30参数技术花了50年时间，其中一个重要原因是硬件的复杂性。基本上，12色流式细胞仪就得需要12-14个独立检测器和40多个光学过滤器，目前高端的30荧光参数流式细胞仪则需要32个独立的探测器（加上电源和前置放大器）和大约50到60多个额外的光学元件。因此复杂性和成本是显而易见的。

　　但问题是为什么许多制造商的持续发展方向都集中在传统的多色和大量过时的检测方法上呢？那些旧的光电倍增管（PMT）技术、旧的滤光片技术，最糟糕的是，旧的补偿技术并没法推进流式细胞术的发展，反而是阻碍。

　　有一种替代方案，既可克服补偿难题，又使得仪器成本仅有原来成本的五分之一，这就是光谱流式细胞术。 我们小组于2004年在国际分析细胞学会（即ISAC）大会上首次提出功能性光谱流式细胞仪检测，然后，在同年16年的Photonics出版物中提出了这一点，随后在2007年Purdue大学获得了ZL。当时的方法原理是使用连接到色散元件的32通道PMT阵列，硬件组件减少到几个光学器件和一个探测器阵列。我走遍了世界、推广这项技术并向NIH申请拨款，以获得资金开发光谱流式细胞仪技术。 美国国立卫生研究院的审查人员认为这是一个荒谬的想法，并拒绝提供资金，尽管有明确证据表明光谱流式细胞仪不仅可行而且具有科学用途。

　　2011年，索尼获得了Purdue大学的光谱技术ZL，并开始开发光谱流式细胞仪。 几年内，多份出版物展示了> 10色光谱流式细胞仪，随后，使用光谱分离，光谱细胞仪已经实现了超过20色的流式细胞仪，具有优异的结果。 实际上，光谱流式细胞仪的目标是将我们关注的焦点从信号强度转移到光谱特征作为最重要的参数。 长期以来，我们一直认为“亮度”是信号最重要的特征，我们忽略了光谱特征的功效。 光谱流式细胞仪可以分析多色流式细胞仪无法充分分离的荧光染料，这是非常重要的。

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　　我最近被问到一个问题，为什么光谱流式细胞仪不是流式细胞仪的前沿和中心。 答案很简单。 多色流式的荧光补偿概念根深蒂固，很多用户向光谱流式转化看起来太痛苦。 我不断提出这样的问题：“当我们有机会去除流式细胞仪的这个邪恶的Bug时，为什么我们还要花费这么多时间和精力专注于补偿呢？” 一个又一个教程，一篇又一篇Paper，一个又一个问题。痛苦难道是流式细胞术的必要组成部分吗？

　　流式中文网注：看到这句话，不仅想插一句，同样，分析也是令很多FLOWER痛苦的一件事情，我们在5月11日昆明线下聚会（报告今天凌晨已截止）发布的流式智子，也是希望能够解除这个痛苦，让分析变得像游戏那样快乐。下面来一幅流式智子的免疫分型实例结果图片（点击放大看原图），珍爱人生，远离手工设门：图片

　　光谱流式细胞仪最终将取代多色流式细胞仪。 这不是问题，而是什么时候。 没有人声称光谱流式细胞仪没有挑战，每种技术都有优点和缺点。 但事实仍然是流式细胞术是一种基于光谱学的技术。 目前的流式细胞仪是光谱学领域中最先进的技术，有足够的扩展能力，有让人兴奋未来。 是时候改变了。