流式细胞仪检测细胞凋亡方法(AnnexinV法)

实验概要

Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。

实验原理

Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。

主要试剂

1. PBS缓冲液：含0.1%NaN₃，过滤后2-8°C保存。

2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。

3. Annexin V试剂与核酸染料：

Annexin V                                                   核酸染料

Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X)          PI(Cat. No. 66211E)或

Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D)          7-AAD(Cat. No. 34321X)

Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X)            PI(Cat. No. 66211E)

Annexin V-PE(Cat. No. 65875X)                7-AAD(Cat. No. 34321X)

主要设备

1. 一次性12×75mm Falcon试管。

2. 微量加样器和加样头。

3. FACS流式细胞仪：上样检测。

4. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。

5. Annexin V检测对照管：

Annexin V    A-阴性对照    B-补偿1                                       C-补偿2

Biotin           SAv-FITC       Annexin V-Biotin和SAv-FITC    PI和SAv-FITC

PE                未染色细胞     Annexin V-PE                              7-AAD

FITC           未染色细胞      Annexin V-FITC                           PI 

实验步骤

1. 取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。

2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1× Binding Buffer缓冲液制成1×10⁶细胞/ml的悬液。

3. Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。

4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：

    管号  名称        荧光标记Annexin V  核酸染料

    1     阴性对照     -                                 -

    2     单阳1        AV-FITC                      -

    3     单阳2          -                                  PI

    4     样本          AV-FITC                     PI

5. 轻轻混匀，室温(20°C ~25°C)避光处放置15分钟。

6. *使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：

1×Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。

1×Binding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。

轻轻混匀。

加入5μl PI，室温(20-25°C)避光处放置15分钟。

7. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μl。

8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。