流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度

血小板胞浆游离钙离子\[Ca2+\]i与血小板的许多形态与功能活动有关，如血小板形态的改变、聚集、收缩、释放、分泌等。也与血小板参与的凝血、血液流变性调节（如血液黏度、流动性等）以及动脉粥样硬化、脑血管疾病的发生和发展、血管内皮活动等生理、病理过程有关。研究发现\[1\]，当血小板内的\[Ca2+\]i达到一定的阈值（400nmol/L）就会发生释放反应以及可逆性聚集。达到另一个阈值（800nmol/L），就会发生不可逆性聚集。因此，研究血小板胞浆游离钙浓度的变化，对阐明血小板参与和调节的许多生理生化以及病理过程有重要意义。人们常用钙荧光指示剂（水母素、Quin2、fura2、Fluro2AM、Fluo3Am）和双波长荧光光度术测定细胞胞浆游离钙浓度\[2-4\]。本文在建立流式细胞术法测定血小板胞浆游离钙浓度的基础上，研究了凝血酶诱导的人血小板胞浆游离钙浓度的变化。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1血液样本       

成人血样，男女兼有，1个月内没有服用阿司匹林及其他影响血小板功能的药物。空腹肘静脉采血，用ACD（ACD∶血=1∶6）抗凝。

1.1.2药品与试剂       

Fluo3AM（溶于DMSO中）、EGTA（溶于超纯度去离子水中）、TritonX100、ADP、凝血酶、小牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma（USA）公司产品。ACD（mmol/L：枸橼酸7,枸橼酸三钠85，葡萄糖100）。Hepes缓冲液（mmol/L:NaCl145,KCl5,MgSO41.0,Hepes10,Na2HPO40.5,葡萄糖10,pH7.4）。CaASAHepes缓冲液（在Hepes缓冲液中加入120mmol/LCaCl2和0.94mmol/LASA，pH7.4）。CaHepes缓冲液（在Hepes缓冲液中加入120mmol/LCaCl2，pH7.4）。其他试剂均为市售产品。

1.1.3主要仪器       

FACSCalibur型流式细胞仪，美国BectonDickinson公司产品。

1.2实验方法

1.2.1富血小板血浆（PRP）制备       

抗凝血200×g离心10min，取上清即得富血小板血浆（PRP）。

1.2.2负载Fluo3AM血小板悬液制备       

取PRP，加入乙酰水杨酸（ASA），使终浓度为0.94mmol/L。轻轻摇匀后800×g离心10min，弃上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes缓冲液1mL，800×g离心10min，弃上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes缓冲液重悬血小板，调节血小板浓度为2×109/mL。在血小板悬液中加入BSA（终浓度为1.5g/L）和Fluo3AM（4.0μmol/L），轻摇混匀后，在37℃水浴孵育30min后，800×g离心10min，弃上清，用1mLCaHepes缓冲液重复2次，洗去溶液中多余的Fluo3AM。用Hepes缓冲液重悬血小板，调节其浓度为2×106/mL。

1.2.3流式细胞仪测定血小板胞浆\[Ca2+\]i        

取负载Fluo3AM的血小板悬液0.5mL，加入3mL聚乙烯试管中，用CellQuest软件获取和分析数据，激发波长为488nm，测定时，用侧向角（SSC）F1（Fluo3AM）散点图识别血小板，用F1直方图测定平均荧光强度。每个样本获取10000个血小板。用CrykiewiczG\[5\]的等比值法公式计算出血小板胞浆\[Ca2+\]i：\[Ca2+\]i＝Kd×（F－Fmin）/（Fmax－F）式中Kd是Ca2+结合Fluo3AM的解离常数，为204nmol/L（37℃）。F为各样本荧光强度的测定值。Fmax和Fmin分别是zui大荧光强度和zui小荧光强度的测定值。

zui大荧光强度和zui小荧光强度的测定：在各试管中加入60g/LTritonX100、5mmol/LCaCl2，摇匀，静置10min，用流式细胞仪测定平均荧光强度，此乃zui大荧光强度。用无钙的Hepes缓冲液重悬血小板，调其浓度为2×106/mL，加入25mmol/LEGTA（钙特异性络合剂），摇匀，静置10min，用流式细胞仪测定平均荧光强度，此乃zui小荧光强度。

1.2.4凝血酶对血小板胞浆\[Ca2+\]i的影响       

分别研究缓冲液中有钙和无钙存在时，凝血酶对血小板胞浆游离钙浓度的影响。在CaASAHepes缓冲液和无钙的Hepes缓冲液中加入凝血酶10、100、1000U/L，用此缓冲液制备负载Fluo3AM的血小板悬液，用流式细胞仪测定10000个血小板的平均荧光强度。为了观察血小板\[Ca2+\]i随时间的变化，分别在加入凝血酶后5、10、15min时各测定一次。
〖2〗西安交通大学学报（医学版）〖3〗第26卷5期〖2〗庄明明，温奕欣，刘少列，等.流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度1.3       统计学方法       所用数据用±s表示，用SPSS10.0version软件和tstudenttest法统计分析实验结果。

2结果

2.1人血小板胞浆\[Ca2+\]i       

将样本放置在样本架上，按下"run"按钮，开始获取数据，以未标记荧光素的样本为空白对照，并用它调整阴性区域的位置，然后依次测定各个样本。结果见图1。

2.2在外钙\[Ca2+\]o存在时凝血酶刺激对人血小板\[Ca2+\]i的影响       

在1mmol/L\[Ca2+\]o存在时，血小板静息\[Ca2+\]i为（108.9±10.5）nmol/L（n=8），在加入10、100、1000U/L凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i明显上升，而且有明显的剂量依赖关系（表1）。100U/L凝血酶可以使\[Ca2+\]i增加6.4倍。5min时，血小板\[Ca2+\]i水平较开始加入凝血酶时降低，10min时接近于静息水平。

2.3无外钙\[Ca2+\]o存在时人血小板\[Ca2+\]i对凝血酶刺激的反应       

在缓冲液中没有钙存在的情况下，血小板的\[Ca2+\]i为（29.5±5.6）nmol/L（n=8），缓冲液中凝血酶的水平为10、100、1000U/L时，血小板\[Ca2+\]i的水平有所上升，但上升的程度明显小于有外钙时。100U/L凝血酶使血小板\[Ca2+\]i增加1.3～1.5倍，并在5min时恢复到静息水平（表1）。表1有或无\[Ca2+\]o时凝血酶对血小板\[Ca2+\]i的影响（略）
    
3讨论

本实验使用的Fluo3AM为细胞可通透的细胞内钙荧光指示剂，在没有水解前和（或）无Ca2+存在时，不显示荧光，低亲和性结合测量到的瞬间Ca2+峰值比Fura2的高\[6\]。TritonX100能增加细胞膜通透性，提高胞浆内Ca2+的浓度，因此，用它测定胞浆内Ca2+饱和浓度。EGTA\[Ethylenelycolbis（2aminoethylether）-N,N,N′,N′tetraaceticacid\]是镁存在时测定钙浓度的鳌合剂\[7\]，也是有效的金属蛋白酶的抑制剂\[8\]，在测定zui小荧光强度时，用EGTA络合胞浆内的Ca2+，使胞外的Ca2+浓度zui低。ASA（乙酰水杨酸）是血小板稳定剂，可以防止血小板聚集，并保证血小板的功能完善。

血小板静息\[Ca2+\]i是指没有任何刺激存在时，血小板胞浆的游离钙浓度。实验结果显示，\[Ca2+\]o为1mmol/L时，人血小板的静息\[Ca2+\]i为（108.9±10.5）nmol/L；\[Ca2+\]o为0mmol/L时，其静息\[Ca2+\]i为（29.5±2.6）nmol/L。在血小板缓冲液中加入凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i迅速上升，而且有明显的剂量依赖关系。\[Ca2+\]o为1mmol/L时，0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升1.58、6.42和10.05倍。另外，\[Ca2+\]o为0mmol/L时，凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高，但提高的幅度明显减少，如0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升0.13、1.3和2.5倍。结果说明，血小板\[Ca2+\]i的高低与\[Ca2+\]o存在与否有密切关系。而且在凝血酶的刺激存在时，\[Ca2+\]i提高的程度也与\[Ca2+\]o有密切关系。提示血小板内钙的升高主要依赖于\[Ca2+\]o的存在，但不排除内钙释放的参与\[9,10\]。

流式细胞术在生物医学和分子生物学研究领域的广泛应用，大大推进了相关学科的发展。结合荧光探针技术，对细胞表面抗原、荧光蛋白表达、DNA含量及其细胞周期、细胞凋亡等进行大量、多参数检测与分析，是流式细胞术的特点。我们应用Fluo3AM和流式细胞术测定血小板\[Ca2+\]i，因为Fluo3AM很容易进入细胞，荧光强度高，操作方法简单易行，测量灵敏度高，重复性好，是研究细胞内\[Ca2+\]i的有效方法。

参考文献：

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[2\]汪钟，王健美，翁进.血小板胞浆游离\[Ca2+\]i浓度测定\[A\].张均田主编.现代药理学方法\[M\]（下册）.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998.1164-1166.

[3\]俞晶，胡文淑.甲基莲心碱对血小板聚集和胞浆游离钙离子浓度的影响\[J\].中国毒理学与药理学杂志,1996,10（2）:120-122.

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[10\]丛玉隆，李绵洋，邓新立，等.高剪切力活化血小板钙离子反应的研究\[J\].中华检验医学杂志,2004,27（1）:13-16.