流式细胞术，怎么处理样本？

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。

一. 试剂准备
Wash Buffer：PBS+1% FBS
破膜剂（ICS）：用双蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。
破膜固定剂：将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍
ICS Wash Buffer：将配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀释 100 倍。

二. 细胞表面染色
收集各组细胞，进行细胞计数，加入适量 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，去上清，加入 50 μl Wash Buffer 重悬。
（可选）Live dead 染色，每管加 0.1 μL Zombie GreenTM Dye（样品多时使用时可先稀释），震荡混匀，室温避光孵育 10～15 min。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min，弃上清。
封闭 Fc 受体：每管中加入 1 μg/106 细胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗体封闭荧光抗体 Fc 受体引起的非特异性染色。震荡混匀，4℃ 孵育 30 min（或室温避光 15 min）。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm，离心 5 min，弃上清。
用适量体积 Wash Buffer 液重悬每个样本，将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管，作为流式检测时调节电压。
单染管中加入相应表面染色抗体，同时在每个样本中加入 1 μL percp CD3/106 细胞和 0.5 μL PE CD4/106 细胞，震荡混匀，4℃ 避光孵育 30 min（或室温避光 15 min）。
用 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，弃上清。
打孔或者加入 200 μL 1% PFA（多聚甲醛）固定过夜。

三. 胞内染色
将全部管细胞固定打孔。每管加入 150 μL 固定破膜剂，震荡混匀，4℃ 避光孵育 20 min。
ICS Wash Buffer 液洗涤，用法同 Wash Buffer 液。
在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体（如 APC IFN-γ抗体），4℃ 孵育 30 min 或室温避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min。
弃离心上清液，根据实际情况加入 200 μL 或者 300 μL Wash Buffer 液重悬。
震荡混匀，流式上机。

四. 注意事项
每一步离心倒掉上清时可以先在实验台上铺几层平板纸，倾倒上清后可吸掉管口的液体。
为了避免打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响实验结果，所以不管是否需要胞内染色，每个样本都需要打孔。
染色时抗体的加入量可根据实际情况调整，为避免抗体浓度对染色的影响，样品染色体系不得大于 100 μL。为减少染色时加样的误差，可配置表面染色抗体稀释液，双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按 10 μL 或 5 μL 体系，用 Wash Buffer 液稀释。
为了避免游离抗体的结合出现假阳性，可洗涤两次。
检测的细胞量不能过少也不能过多，细胞太少检测时样本流量会增大影响变异系数，细胞过多，可能会导致抗体或染料相对不足，影响实验结果。