测序结果的分析

测序都是从5'端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。生工测序结果一般都提供两个文档，一个是TEXT的序列文档，一个是用Chromas软件打开的ABI文档。

1.寻找引物

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 比对，去除引物序列，找到目的片段。

在DNAMan上进行比对，看引物能不能比对上（一个不变，一个反向互补），如果比不上，那可能就不是你要的序列，如果能比上，上游以引物第一个为分界线，去除前面的；下有一最后一个为分界线，去除后面的，剩下的就是目的序列。然后在NCBI上Blast.就OK了。

批注：PCR产物进行测序的结果可能不包含引物序列

2.将找到的对应目的片段转成*.txt格式

3.下载BioEdit软件

第一：打开Bioedit软件，导入拼接好的样品序列与标准亚型参考序列

File—New Alignment—Sequence—New Sequence—导入拼接好的样品序列和标准参考序列（从TEXT文档利用复制粘贴工具）—Apply and close —保存结果—关闭窗口

第二：点击菜单栏上按钮“Accessory Application”，选择“Clustalw Multiple Alignment”

File—Open—Accessory Application—Clustalw Multiple Alignment

第三：比对结束后，删除比对序列两端的多余序列，使所有序列等长

选择需要编辑的序列—Sequence—Edit Sequence—进行序列的编辑—保存修改后结果

第四：选择“Sequence”菜单下的“Gaps”，点击“Lock Gaps”

第五：将比对后的序列保存为Fasta 格式文档

4.下载MAGE4.0软件

1)    打开MEGA软件，选择“File”菜单栏中的“Convert To MEGA Format”，把序列文件的格式转换为meg文档保存；

2)    双击序列的meg文档，选择“Nucleotide Sequences”，点击“OK”；

3)    程序运行中询问是否为蛋白编码序列，选择“NO”；

4)    在MEGA操作界面选择“Phylogeny”菜单栏下“Bootstrap Test of Phylogeny”中的“Neibour-Joining”；

5)    选择“Test of Phylogeny”栏中的“Bootsrap”，“Replications”设定为1 000；在“Options Summary”栏中的“Model”项中，设定参数为“Kimura 2-Paramete”r，最后选择“Compute”；

6)    将分析结果采用Los Alamos HIV序列库提供的HIV-BLAST和Subtyping工具进行验证