海藻酸裂解酶的应用条件优化

1 材料和方法
1.1 主要培养基
1.1.1 分离纯化培养基
硫酸氨 0.5g，K2HPO4 0.2g，NaCI 3.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO47H2O 0.001g，褐藻酸钠1g，琼脂 2.0g，蒸馏水100mL，pH7.5。
1.1.2 发酵培养基
蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.1g，褐藻酸钠 0.5g，NaC1 0.5g，蒸馏水100 mL，pH7.5。
1.2 菌株的分离与纯化
剪取小段海带，镊取其病烂部位的较小叶片，在无菌海水中漂洗3次，然后分别贴在分离纯化培养基平板上。将培养基置于23℃ 恒温培养48h，再利用梯度稀释进行菌株的分离与纯化。选取11个生长较好的单菌落，编号为1(1)，2(1)，3(1)，4(1)，5(1)，6(1)及1(2)，2(2)，3(2)，4(2)，5(2)，做梯度稀释(至10倍)，然后10一，10一，10倍分别取0.2、0.3mL，滴于分离纯化培养基上，用涂布器铺匀，置于23℃恒温培养。
1.3 液体菌种培养
将上述11株菌，分为两批。分别接一环菌种于20mL发酵培养基中(100mL三角瓶)，23℃摇瓶培养12h。
1.4 产酶的发酵实验
每批均在100 mL三角瓶中，装入pH 7.5的发酵培养液30mL，并且按照2.5％ 的接种量接入液体菌种，于25℃下恒温摇瓶培养144h，测定发酵液的酶活力。
1.5 标准曲线的绘制
参照3，5一二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。称取干燥至恒量的葡萄糖醛酸100mg，溶解定容至100mL。分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的葡萄糖醛酸溶液于5支比色管中，同时吸取1.0mL蒸馏水于另1支作空白，其他均用水稀至1mL。再分别加入3mL的3，5．二硝基水杨酸显色剂，于沸水中煮沸显色15 min，冷却，各加入蒸馏水定容至25 mL，摇匀，用722S型分光光度计于350nrn处测光密度。取平均值，以光密度为纵坐标，葡萄糖醛酸毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
1.6 酶的活力测定
3，5一二硝基水杨酸法测定酶活力，利用比色法测定酶解后还原产物的生成量，以表示酶的活力。具体为：吸取1mL发酵液，2mL 1％褐藻酸钠溶液(pH7.0的1／15N 的磷酸缓冲液配制)，于试管中混匀，并且，以1mL蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。置于40摄氏度水浴糖化30 min，取出后立即于沸水中煮沸15 min使酶失活。冷却，过滤，吸取1 mL滤液于比色管中，加入3.5一二硝基水杨酸显色剂3mL，再沸水浴15min，冷却，用蒸馏水定容至25mL，混匀，在550nm下测光密度(用蒸馏水调零)。酶活力单位定义为，在实验条件下，每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成1g还原糖所需的量。