液体活检分析，怎么少得了流式细胞仪？

　　个性化医疗的热潮以及微创的采样程序，让液体活检（liquid biopsies）成为转化研究的新宠。血液、痰液、尿液等体液中也许隐藏了重要的信息，让你了解某个人是否会心脏病发作，患上阿尔茨海默病，或者特定疗法对他的癌症是否有效。

　　为了获得这样的证据，研究人员正在千方百计寻求各种资源，如游离DNA（cfDNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、代谢产物、细胞外囊泡以及细胞本身。各种各样的技术和仪器都被委以重任。在此，我们来看看流式细胞术可在液体活检中发挥什么样的作用。

　　为何上流式？

　　众所周知，流式细胞术是一种功能强大的高通量技术，可以根据荧光和光散射特性来分析颗粒。利用一组荧光标记的抗体，不同的表面和内部标志物可被标记；前向散射可反映颗粒的大小，而侧向散射可粗略表示其粒度。

　　举个栗子，对于白膜层中的细胞，你可以用针对上皮细胞粘附分子（EpCAM）、细胞角蛋白（CK）和CD45分子的抗体进行染色。然后，在流式细胞仪上检测这些细胞，并对表达CK和EpCAM但不表达CD45（白细胞的标志物）的稀有细胞进行定量。这就是CELLSEARCH的原理，它是一台经过FDA批准的系统，可以通过简单的血液检测来鉴定循环肿瘤细胞（CTC）。

　　南加州大学凯克医学院的主任Julie Lang指出，流式细胞术只是大海捞针的几种方式之一。在过去几年，根据细胞表面标志物（如EpCAM）分离CTC的产品已经推出，而其他产品则是基于大小、变形性等物理性质。不过，由于流式分析需要排队和准备，Lang的团队已使用Angle Parsortix系统来搜索CTC。“RNA迅速降解，因此如果标本放了几个小时，那就不再适用于癌症研究，”Lang解释说。

　　不过，宾夕法尼亚大学的病理学教授Jonni Moore认为，流式细胞术的多维度赋予了无以伦比的特异性。某些肿瘤细胞的EpCAM可能下调，因此不符合CELLSEARCH的标准。“有时，标志物会在非肿瘤细胞上广泛表达，而物理分类也并非100%准确，因此会造成假阳性结果，”Moore说。人们使用流式细胞术的主要原因就是查看更多标志物，比如，确保假定的乳腺癌细胞来自乳腺。

　　CTC是从原发性和转移性肿瘤中脱落的，被认为是转移性疾病的罪魁祸首。有了流式细胞仪，研究人员能够追踪癌症的演化，也许从中能够获得与活检不同的治疗启示。同样地，通过长时间观察CTC，他们也能了解治疗的效果如何。当然，Moore认为，流式细胞术的特异性加上基因组学的灵敏度，这才是理想的组合。

　　仪器选择多

　　许多研究人员在流式分析之前，选择富集EpCAM+细胞，或去除CD45+细胞。这一般是通过磁珠来完成的。BD Biosciences正在开发FACSFocus仪器，它将利用免疫磁性分离和声波洗涤。“没有离心，这也意味着我们不会丢失细胞，”Moore说。

　　Moore及其同事已经利用这款仪器来检测和鉴定循环的胰腺癌细胞，它们具有转移的潜力。“你无法通过流式以外的技术来实现这一点。芯片技术现在不大适合，但未来不好说，”她说。

　　目前，流式细胞仪正在快速发展。“越来越多的小容量细胞分析仪、芯片型分析仪，让我们能够检测少量样品，无论它们是来自血液，还是组织本身。”

　　据加州大学洛杉矶分校的神经学家Karen Gylys介绍，一些新型的流式细胞仪，比如Apogee Flow Systems的Micro Flow Cytometer，关注小的颗粒。“至少从理论上说，它处在外泌体（exosome）的范围内，大约是100 nm。”其他供应商也在开发类似的仪器，虽然不是专用的，但也能区分小的颗粒。

　　细胞外囊泡

　　循环的细胞外囊泡（ECV）就很小。它们可能含有microRNA、mRNA、DNA以及其他核酸和蛋白质，而它们的膜富含某些表面标志物，如CD9、CD63和CD81。ECV一度被认为是细胞碎片或废物，但其实也是细胞间通讯的一种手段。尽管目前有多种说法，但ECV、EV、外泌体这些术语大多指的是同一种东西。

　　作为癌症、脑损伤、心血管疾病以及其他疾病的标志物，ECV已经被广泛研究。不过，流式分析只参与了一小部分。使用传统的流式分析仪研究ECV的困难在于，样品制备太麻烦了，通常涉及到超速离心。此外，由于颗粒很小，流速需要小心控制。

　　不过，随着新的仪器、试剂和信息学工具的出现，这种情况应当会有所改变。一些供应商推出了完整外泌体的分离试剂盒。比如，美天旎最近推出了MACSPlex Exosome Kit，它通过磁珠利用广谱的标志物来捕获外泌体。通过流式细胞分析，在单个实验中就能鉴定30多种外泌体表面标志物。

　　尽管目前分析ECV的特征还是挑战重重，但Moore认为，“ECV真的是一座金矿。”他预测，“两年内，对于生物标志物等研究，人们对ECV的兴趣将超过细胞。”无论这是否成真，但基于流式细胞术的液体活检研究无疑有着光明的前景。